鸦胆子治疗卵巢癌作用机制的网络药理学研究

彭芸花， 李道宽 ，肖曼 ，何帅

(1 海南医学院 第二附属医院,海口 571000；2 兰州大学 第一医院,兰州 730000；3 海南医学院 生物化学及分子生物学教研室，海口 571000)

卵巢癌是严重威胁女性生命的生殖道恶性肿瘤[1]，据统计2015年中国卵巢癌新发病例为5.21万,死亡人数高达2.25万[2]. 卵巢癌起病隐匿，一经发现多为晚期，晚期卵巢癌易盆腹腔广泛转移、原发或继发化疗多药耐药及易复发，导致死亡率高居不下，5年生存率仍徘徊于40%[3-4]. 中药因其作用多靶点、多功效、副作用低、经济实用等优点在肿瘤治疗中发挥着不可替代的作用. 鸦胆子(Bruceajavanica)性味苦、寒，具有清热解毒、治疗疟疾等功效，研究发现其具有抗肿瘤作用[5]，但作用机制不明. 本研究利用生物信息学大数据分析的优势，运用网络药理学方法构建有效药物成分-基因靶点-信号通路网络图，初步预测出鸦胆子治疗卵巢癌的潜在作用机制，为进一步深入研究提供了参考和依据.

1 材料与方法

1.1 数据来源

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform TCMSP:http:/ /ibts.hkb.edu.hk/LSP/tcmsp.php；a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine BATman-TCM：http://bionet.ncpsb.org/batman‐tcm/；Traditional Chinese Medicine Information Database TCM‐ID:nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx)、TCMSP、TCM-ID、NPSS 、Swiss Target Prediction: (http://swisstargetprediction.ch/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)、DRUGBANK数据库、结合蛋白质数据库(UniProt:http://www.Uniprot.org/).

1.2 药物成分的筛选及潜在基因靶点的预测

通过TCMSP、BATman-TCM、TCM‐ID、NPSS检索出鸦胆子的成分，再根据成分药物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME) 参数[6]设置条件，对符合药物口服生物利用度 (oral bioavailability，OB) ≥30% ，类药性值(drug-likeness，DL)≥0.18 的成分进行筛选，得出鸦胆子的有效活性成分. 再通过 TCMSP 平台、NPASS数据库、TCM-ID数据库、Swiss Target Prediction平台预测出上述有效活性成分作用的潜在基因靶点，应用Cytoscape3.6.0软件对其进行可视化处理，构建出成分-潜在基因靶点的网状关系图.

1.3 人卵巢癌相关基因的检索

通过DRUGBANK、OMIM及DisGeNET数据库检索出与人卵巢癌显著相关的基因，获得所有已知的与卵巢癌有关的基因靶点.

1.4 关键基因靶点的挖掘及基因功能分析

通过比对1.2和1.3检索出的基因，筛选出共同基因，Cytoscape3.6.0进行可视化处理，构建网络关系图. 在DAVID数据库进行GO生物学功能分析，得出关键基因靶点的生物学功能.

1.5 通路富集分析

对上述关键基因靶点映射到DAVID数据库进行KEGG富集信号通路分析，找到主要的信号通路.

2 结果

2.1 鸦胆子活性成分及潜在基因靶点

检索出鸦胆子的化学成分67种，根据OB和DL 值等 ADME参数(OB≥30%，DL≥0.18)筛选到具有生物活性的成分15种，根据分子式、Smile等化学结构最后确认12种化合物(表1). 通过NPSS预测出与这些活性成分作用有关的基因靶点有11个、BATMAN-TCM有91个、TCM-ID有113个，经筛选去除相同的成分后得到最终成分185个，利用TCMSP靶点及模型预测技术再次预测与鸦胆子活性成分相关作用的靶点，排除重复后共获得124个靶点. 利用 Cytoscape3.6.0软件制作成分-靶点网络图(图1).

表1 鸦胆子有效活性成分和类药性值Tab.1 Effective active ingredients and DL of Brucea javanica

椭圆形为化合物，菱形为靶点图1 成分-靶点作用网络图Fig.1 Component-targets network

2.2 关键基因靶点的挖掘

通过DRUGBANK、OMIM及DisGeNET数据库检索出与人卵巢癌发生、发展显著相关的基因靶点有622个，其中与预测的鸦胆子成分潜在基因靶点交集的基因有33个，作为药物-疾病共同的关键基因靶点.

2.3 基因功能分析

将33个基因靶点在DAVID数据库进行GO生物学功能分析(P<0.05)，得出鸦胆子活性成分与卵巢癌交集的靶基因的生物学功能包括：调节胰岛素受体信号通路、细胞内信号转导、基因表达的调节、调控转录及基因表达.交集靶基因的细胞学功能主要作用于内质网、细胞质、质膜及核周.交集靶基因的分子功能包括：蛋白激酶活性、血小板活化、肽酰丝氨酸磷酸化、蛋白激酶活性、钙依赖性蛋白激酶C活性、ATP结合、蛋白质磷酸化、金属离子结合及酶结合等(表2).

表2 鸦胆子作用于卵巢癌的 GO分析结果
Tab.2 GO analysis ofBruceajavanicaon ovarian cancer

分类GO ID名称P值生物功能0044212transcription regulatory region DNA binding5.65E-040008283cell proliferation0.0080859270045893positive regulation of transcription, DNA-templated0.0228805590007165signal transduction0.0429887090010628positive regulation of gene expression0.0357701610035556intracellular signal transduction9.44E-050046627negative regulation of insulin receptor signaling pathway1.57E-040008285negative regulation of cell proliferation0.0265052050005886plasma membrane0.0015834720048471perinuclear region of cytoplasm0.0041439220005622intracellular0.005294442细胞功能0005829cytosol0.0061796160005783endoplasmic reticulum0.0117248360004697protein kinase C activity1.33E-100030168platelet activation6.64E-070018105peptidyl-serine phosphorylation9.27E-070004672protein kinase activity1.76E-060004698calcium-dependent protein kinase C activity2.31E-060005524ATP binding1.49E-04分子功能0006468protein phosphorylation1.52E-040004674protein serine/threonine kinase activity0.0015834720008270zinc ion binding0.0050898680003682chromatin binding0.0256319980019899enzyme binding4.40E-050046872metal ion binding0.006713230043234protein complex0.024502495

2.4 通路富集分析

将33个交集靶点映射到DAVID数据库进行KEGG信号通路分析(P<0.05)，交集靶基因主要涉及的14条信号通路包括：TRP通道的炎症介质调节，癌症的途径，mTOR信号通路，VEGF信号通路，ErbB信号通路，MAPK信号通路，Wnt信号通路及钙信号通路等(表3).

表3 鸦胆子作用于卵巢癌的KEGG分析结果Tab.3 KEGG analysis of Brucea javanica on ovarian cancer

2.5 成分-靶点-信号通路网络图的构建

利用STRING构建鸦胆子靶点的PPI网络(图2)，线条的粗度与蛋白间的关联度成正比，线条越粗，关联度越大(图3).

图2 鸦胆子作用于卵巢癌的PPI网络图Fig.2 PPI network graph of Brucea javanica on ovarian cancer

图3 鸦胆子作用于卵巢癌的成分-关键靶点-信号通路图Fig.3 Components-key targets-signal pathway diagram of Brucea javanica on ovarian cancer

图中可看beta-sitosterol、luteolin、brusatol等有效生物活性成分包含TP53、ERBB2、PRKCA、PRKCG、TNF等12个关键靶点，这些靶点分布于不同的代谢通路，如VEGF 信号通路，ErbB信号通路及Wnt信号通路等. 由此表明，鸦胆子从多种途径对卵巢癌产生抑制作用机制.

3 讨论

卵巢癌早期临床表现隐匿，诊断困难，晚期疾病进展快，易发生腹腔广泛转移及化疗多药耐药，易复发. 目前虽然手术技术不断提高，化疗方案越来越规范，化疗新药的副作用也逐渐减低，但卵巢癌的总体生存率无明显改善[3]，仍是严重威胁女性生命的主要生殖道恶性肿瘤. 有研究发现，鸦胆子油乳注射液作为传统中药鸦胆子的提取成分，与顺铂联用能够逆转A2780/DDP细胞顺铂耐药[7]，并通过抑制拓扑异构酶的活性来抑制DNA的复制、翻译及转录，促进体内干扰素的合成诱导细胞凋亡[8]，但具体机制不明.

通过网络药理学方法分析药物有效成分—作用靶点—信号通路—疾病关系，构建网络调控模型，发现鸦胆子的多个有效成分能够作用于多个靶点和信号通路，发挥不同的生物学效应；不同成分的作用靶点和信号通路互相交集，又各有主次；信号通路之间通过共同靶点相连接，显示出不同成分间的多靶点协同作用，符合中药学的特点，形成一条“成分一靶点一通路一疾病”的网络药理学模式，其中主要涉及的信号通路包括TRP通道的炎症介质调节、癌症的途径、mTOR信号通路、VEGF信号通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路及钙信号通路等[9-11].

本研究初步揭示了鸦胆子治疗卵巢癌的多维调控网络关系，预测得出的信号通路、生物学功能也与文献报道相吻合，说明基于网络药理学预测靶点及信号通路，对指导肿瘤的机制研究具有可行性.