ROS介导γ-氨基丁酸调控拟南芥根毛发育机制研究

余光辉,向宇,宫雅昕,李刚

(中南民族大学 生命科学学院，南方少数民族地区生物资源保护与综合利用联合工程中心，武汉 430074)

根毛是根部表皮细胞分化形成的一种单细胞管状物, 根毛可以增加根的表面积,有助于植物对水分和营养物质的吸收以及植物在土壤中的固定[1].

γ-氨基丁酸(GABA)是一种含有四碳的非蛋白氨基酸[8],研究发现植物在胁迫的条件下，GABA可以作为一种代谢物积累,并抑制ROS的产生[9].此外GABA还可以作为一种信号分子诱导气孔的关闭[10].

为研究GABA在拟南芥根毛发育中的调控作用，本研究以拟南芥特异性表达的GABA合成酶基因突变体(gad1)的根为材料,通过外源施加GABA，对根部活性氧进行染色和对活性氧合成及清除相关基因表达水平的分析,探讨GABA和根毛发育调控的潜在机制.

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)包括野生型Columbia(Col)和内源性GABA合成突变体(gad1).

将拟南芥的种子用氯气消毒2～3 h. 在超净台中,用无菌牙签将拟南芥种子分别接种于1/2MS和含有不同浓度GABA的1/2MS(pH=5.8)固体培养基上,用胶带对方形塑料培养皿(10 cm×10 cm)进行密封,放于4 ℃冰箱，春化2 d. 然后放入温室(16 h/8 h光/暗循环,温度22 ℃)垂直培养8 d.

1.2 拟南芥根部根毛形态及长度的测量

将拟南芥幼苗(8 d)培养皿置于体视显微镜(V8,德国蔡司)下,对距根尖前8 mm区域上的根毛进行拍照. 用软件SPOT Advanced对根毛长度进行测量(每条根上选取25～30个完全伸长的根毛的进行统计). 每个株系统计20株以上的幼苗.

1.3 活性氧(ROS)染色观察

植物体内活性氧(ROS)的水平可以通过H2DCFDA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)荧光探针进行检测[11]. H2DCFDA进入细胞后能被活性氧基团分解为DCF而产生荧光,其荧光强度与活性氧浓度成正比.

将生长8 d的拟南芥幼苗放入含有10 μmol·L-1H2DCFDA染液的溶液中,避光孵育1 h. 随后用蒸馏水冲洗3次,将染好的幼苗制片后放入IX73荧光显微镜(日本奥林巴斯 )的载物台上,在相同的曝光时间和背景下观察荧光并拍照.

1.4 超氧阴离子染色

将8 d龄的拟南芥幼苗置于含有2 mmol·L-1NBT(氮蓝四唑)的磷酸盐缓冲液(pH=6.1)中[12]. 避光染色15 min,用蒸馏水冲洗,将染好的幼苗制片后放入IX73荧光显微镜下观察并拍照.

1.5 实时荧光定量PCR分析

采用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(康宁公司)提取拟南芥根部总RNA,利用反转录试剂盒(Goldenstartm RT6)用于cDNA的合成. 实时荧光定量PCR采用2×T5 Fast qRT-PCR Mix (SYBR Green Ⅰ)试剂盒(北京擎科),操作按照说明书进行,引物参见表1. 用MyGo Pro 定量PCR仪 (英国IT-IS公司)进行实时荧光定量PCR,反应条件为：95 ℃预变性1 min,95 ℃变性10 s,53 ℃退火15 s,72 ℃延伸10～15 s,40次循环. 基因相对表达水平用2-ΔΔCq进行计算分析.

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.6 数据统计分析

根毛长度统计每组实验单独重复3次,每次统计9棵拟南芥幼苗. 利用SPSS 23软件对统计的根毛长度及qRT-PCR结果进行显著性分析(t-检验),用Image J软件对荧光和染色强度进行量化.

2 结果与分析

2.1 gad1突变体根毛长度高于野生型

在培养基(1/2MS)上垂直生长8 d后,测量野生型和gad1突变体根毛的长度. 野生型根毛平均长度为490 μm,gad1突变体根毛平均长度为700 μm, 是野生型的1.5倍, 显著大于野生型(P<0.05) (图1A～C). 说明GABA合成缺陷促进了拟南芥根毛的顶端生长,导致其根毛的长度增加.

A)8 d龄的野生型拟南芥初生根和根毛;B)8 d龄的gad1突变体初生根和根毛;Bar=1 mm;C)根毛长度的测量，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图1 野生型和gad1突变体的根毛长度Fig.1 Root hair length of wild type and gad1 mutants

2.2 外源性GABA抑制野生型根毛伸长

用不同浓度的GABA处理野生型拟南芥,在生长8 d后在体视显微镜下观察根毛生长情况. 结果表明, 不同浓度的外源GABA (1、10、100和1000 μmmol·L-1)的添加均显著抑制了野生型拟南芥根毛的生长，处理组长度明显低于对照组,分别比对照组降低了44.8%、53.9%、57.1%、73%，抑制呈现明显的剂量依赖效应(P<0.05)(图2，A～F).

A)、B)、C)、D)和E)分别为0、1、10、100和1000 μmol·L-1 GABA处理后生长8 d的野生型拟南芥,Bar =1 mm; F) 不同浓度GABA处理下野生型拟南芥根毛长度的测量，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图2 不同浓度GABA处理下野生型拟南芥根毛的长度Fig.2 Length of root hair of wild type Arabidopsis thaliana treated with different concentrations of GABA

2.3 外源 GABA一定程度上抑制gad1突变体的根毛生长

为进一步证实根毛生长和GABA代谢的关系,用外源GABA处理gad1突变体.结果表明,10 μmol·L-1GABA处理情况下,gad1突变体中快速生长的根毛生长得到显著抑制, 其长度也短于野生型(P<0.05)(图3，A～E). 以上结果说明GABA代谢参与了拟南芥根毛生长的调节.

2.4 gad1突变体根部ROS的水平高于野生型

活性氧(ROS)是调控根毛发育的重要信号[2].为证实gad1根毛生长和ROS的关系，用H2DCFDA探针来检测ROS的水平.在培养8 d的野生型拟南芥和gad1突变体进行H2DCFDA标记后,在根尖和根毛区都观察到ROS的荧光分布,但gad1突变体中ROS的荧光信号强度明显高于野生型(P<0.05) (图4A～D;E,F).上述结果表明,ROS介导了gad1突变体根毛伸长的过程.

2.5 gad1突变体根部超氧阴离子水平高于野生型

A) 1/2MS培养基上野生型生长的根;B) 1/2MS培养基上gad1突变体生长的根; C)添加10 μmol ·L-1 GABA的生长的野生型的根; D)添加10 μmol ·L-1 GABA的生长的gad1突变体的根,Bar =1 mm; E) 根毛长度的统计，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图3 10 μmol·L-1GABA处理下gad1突变体根毛的长度Fig.3 Length of root hair of gad1 mutant treated with 10 μmol ·L-1 GABA

A)、C)分别代表野生型和gad1突变体拟南芥根尖的ROS染色结果;B)、D)分别代表野生型和gad1突变体根毛区的ROS染色结果， Bar =50 μm;E)、F)根尖和根毛尖端平均荧光强度的量化统计，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图4 根尖和根毛区ROS的分布Fig.4 Distribution of ROS in root tip and root hair region

A)、B)分别为野生型和gad1突变体根尖NBT染色的结果;C)、D)分别为野生型和gad1突变体根毛区域NBT染色的结果， Bar=100 μm,箭头指向根毛尖端; E)根毛尖端NBT染色信号的量化统计，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图5 根部的NBT染色Fig.5 NBT staining for in root

2.6 外源GABA抑制根毛尖端ROS的产生

A)、B)分别为根毛尖端ROS荧光染色和NBT染色信号的量化统计，各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图6 外源GABA对根毛尖端ROS荧光染色和NBT染色的抑制效应Fig.6 Inhibition of exogenous GABA on the staining of ROS fluorescence and NBT staining for

2.7 根部ROS合成及清除相关基因的表达变化

各柱形图上不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)图7 野生型和gad1突变体根部合成及清除ROS基因的表达变化Fig.7 Gene expression involving in synthesis and scavenging ofROS in the roots of wild type and gad1 mutants

2.8 外源GABA诱导根部ROS清除基因的表达

各柱形图上不同小写字母标识表示数据间的差异显著(P<0.05)图8 外源GABA处理对ROS清除基因表达的影响Fig.8 Effect of exogenous GABA treatment on the expression of ROS scavenging genes

3 讨论

根毛是植物吸收土壤水分和营养的关键器官,根毛的发育直接关系到植物吸收养分的能力. 研究表明,γ-氨基丁酸(GABA)在植物细胞中产生，具有调控生长和抗逆性的作用[13].本文利用GABA合成突变体gad1及外源性GABA的添加证明了GABA在拟南芥根毛生长中的调控作用.

胁迫条件下, GABA与ROS有着密切的联系.胁迫导致线粒体中的ROS水平升高从而激活GABA的产生,大量积累的GABA又会对ROS进行清除[15]. 研究表明,在莴苣幼苗中,外源GABA的应用可以降低ROS的产生,使自身的耐盐性增强[16]. 在大麦幼苗中,铝和质子的胁迫会造成大麦的氧化损伤,外源GABA的添加可以减轻这种损伤[17].所以在胁迫的条件下, GABA确实可以作为一种抑制ROS产生的调节器发挥功能;前期的研究证实了外源GABA对ROS具有抑制和清除效应[9,18].