杆菌细胞形变的机制与功能

2019-12-22王蕾邹琳李梦洁侯琳琳陈小明刘伟孙桂芹陈力

微生物与感染 2019年2期

王蕾，邹琳，李梦洁，侯琳琳，陈小明，刘伟，孙桂芹，陈力

1. 复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032； 2. 浙江省水利水电装备表面工程技术研究重点实验室，浙江杭州 310024； 3. 浙江中医药大学医学技术学院，浙江杭州 310053

细胞是生命的基本单元，显微镜下观察到的细胞形态是细胞最重要的生物学特征。细菌是无核单倍体的单细胞生物，显微镜下其基本形态有球形、杆状、弧形和螺旋形。研究发现，细菌基本形态之间存在相互转化的特定机制。在合适的生长条件下，细菌合成新的染色体，经细胞分裂产生新的单细胞。新生细胞间的连接方式如双球、八叠、成链等，是细菌细胞形态的另一个主要特征。此外，细菌的形态还受培养条件、生存环境及宿主免疫特异性组分功能和活性的影响。细菌形态是细菌主要分类及临床诊断的依据，由基因组、基因组表达谱及其他环境因素共同决定。在特定环境及生理条件下，细菌细胞具有形变能力。细菌虽小，其独立的生命活动却不容忽视。其在代谢过程中产生抗生素、维生素等多种代谢产物，可为人类生产、生活和医疗卫生利用。因此，细菌细胞形变研究对临床抗生素用药指导及新型抗生素研发和生产有重要意义。

1 细菌基本形态的转变

细胞形态是细菌分类与鉴定的重要参数。根据细菌细胞在显微镜下的形状，细菌可分为球菌、杆菌、弧菌和螺菌四大类[1]。球菌的外观呈圆形或类球形，直径约1 μm。杆菌的基本形态为直杆状，菌体两端多呈钝圆形。杆菌可细分为小杆菌(菌长 0.6～1.5 μm，如布鲁杆菌)、中杆菌(菌长2～3 μm，如大肠埃希菌)和大杆菌(菌长3～10 μm，如炭疽芽胞杆菌)。菌体呈弧形弯曲的弧菌和呈螺旋状的螺菌也较为常见，其中弧菌菌体总长2～3 μm，螺菌菌体总长3～6 μm[2]。L型细菌和芽胞是两种特殊的细菌形态。细菌形成球形、杆状、弧形还是螺旋形的分子机制一直是微生物学领域的焦点之一。

1.1 杆状与球形之间的转变

研究表明，决定细菌形态的分子可能参与细菌分裂过程[3]。 Ogura等于1989年分离得到杆菌变为球菌的突变株，发现该突变出现在青霉素结合蛋白2(penicillin-binding protein 2，PBP2)上[4]。后续研究表明，由PBP蛋白功能缺陷导致的肽聚糖结构改变可引起细胞形态发生变化[5]。2001年，Jones等发现枯草芽胞杆菌中MreB蛋白的缺失突变导致了细菌从短棒状变成球形[6]。这一现象在大肠埃希菌中也得到了验证[7]。mreB基因突变的球形菌中，染色体分离受到影响，出现了染色体缺失的球状体[8]。结果提示，MreB蛋白与细菌染色体分离相关[9]。Wachi等发现MreB蛋白的抑制剂A22能快速干扰MreB蛋白的多聚化和胞内定位，导致细菌杆状形态丢失甚至死亡[9-10]。后续研究发现，形成多聚体的MreB蛋白沿着细胞内壁呈圆周运动，调控细胞壁生长的空间位置来控制细菌的形态[11-14]。以上研究表明，MreB蛋白是细菌形态建立、维持和调控过程中的关键因子之一[15]。

1.2 弧形与杆状之间的转变

弧形细菌可在一定条件下转变成杆菌。2003年，Ausmees等发现单基因creS的突变不影响细菌生长，但可使在平台期生长的弧状新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)变成长丝状的杆菌[16]，并于2009年再次发现表达单基因creS就能导致大肠埃希菌呈弧形生长[17]。此外，2017年Bartlett等发现霍乱弧菌(Vibriocholerae)的CrvA蛋白突变可导致杆状形变，是重要的致病因子[18]。研究发现，CreS或CrvA在外周质空间中均呈不对称分布，均仅在单侧存在，调控定位一侧的生长速度而导致曲面形成[17-18]。

1.3 螺形的转变

螺形菌幽门螺杆菌的形态突变体中，csd1基因突变引起弧形改变，csd4基因引起杆状改变，csd3基因突变导致多种变形，菌体形态的改变影响了细菌在小鼠体内的定植[19-20]。生物信息学预测和体外实验表明，csd1可能编码肽聚糖内肽酶，csd4编码的蛋白具有肽聚糖羧肽酶活性[21]，csd3基因也可能编码肽聚糖内肽酶[19]。以上结果提示，菌体弯曲和螺旋的产生可能是基于肽聚糖的交联程度。

1.4 L型细菌

L型细菌或细胞壁缺陷型是指细胞壁受损但仍能生长和分裂的一类特殊形态的细菌。由于肽聚糖缺失，细菌呈大小不一的球形、杆状或丝状等形态[2]。1935年，Klienberger首次报道了念珠状链杆菌的L型菌体，发现其菌落和形态与支原体相类似[22]。虽然自然条件下出现L型细菌的机制并不清楚，但已知培养时持续阻断和抑制细胞壁合成及保持培养基与细胞质等渗，是稳定诱导L型细菌形成的两个要素[23-24]。研究表明，与正常细菌相比，L型细菌可能不依赖分裂中板的形成，可经不对称挤出-分离的方式完成增殖[25]。临床研究中，Beaman在接种了诺卡菌的小鼠肺中观察到了L型细菌[26-27]。2001年，Woo 等研究发现，造血干细胞移植手术后的患者在免疫抑制期间有被L型细菌感染的风险[28]。随后2005年研究发现，在使用以细胞壁为靶点的抗生素(如β-内酰胺类)治疗过程中，会出现导致慢性感染的L型细菌[29]。此外，缺失细胞壁成分可能有利于细菌获得耐药性[29]。2015年，Kawai 等的研究结果表明，细胞壁合成被阻断时发生的代谢失衡生理补偿对L型细菌的增殖至关重要，为针对细菌细胞壁的抗生素的作用模式提供了新见解[30]。

1.5 芽胞

芽胞是细菌在严酷环境中产生的一种休眠状态[31]，在营养极度缺乏的条件下形成[32]。芽胞的形成由一个特殊的细胞分裂和分化过程组成。以枯草芽胞杆菌为例，在特殊的分裂过程中，经不对称分裂形成前芽胞和母菌。在分化过程中，经历以下几个阶段：芽胞包皮质层的形成、芽胞外衣的生成、芽胞的脱水与成熟、母细菌程序性死亡后芽胞的释放[33]。根据分裂和分化的结果，芽胞在菌体中的位置主要有3种类型：极端、中间和次极端。有关芽胞分化的分子机制研究，请参见相关综述[32]。

2 杆菌丝状形变的分子机制

细菌的形变可分为基本形态间的转变和基本形态内的变形。研究表明，杆菌丝状形变表型的出现与细菌细胞周期控制点的失控有关。细菌的细胞周期包括3个过程：细菌的生长(G期)、染色体的复制分离(S期)和细胞分裂(D期)。其中，细胞分裂由分裂中板的形成和菌体的分离两个步骤构成[34]。细胞对每个过程完成的质控点被定义为细菌细胞周期控制点，其主要功能是阻止下一个过程的发生。

研究表明，S期过程受阻可导致细菌发生丝状形变，该形变被称为SOS丝状形变[35-36]。SOS之所以会诱导出细菌的丝状形变，是因为SOS诱导后产生的细胞分裂抑制蛋白SulA可特异性地与细胞分裂蛋白FtsZ单体结合，从而抑制FtsZ的多聚化[37-40]，导致细菌正常分裂所需的“Z环”不能在分裂中板有序进行[41]。胞内SulA蛋白表达在转录水平受转录因子LexA负调控，在蛋白水平受蛋白酶Lon负调控。胞内DNA受损导致LexA蛋白降解，由此启动SulA蛋白表达，抑制细胞分裂的发生[42]。当染色体DNA损伤修复完成后，SulA蛋白被Lon蛋白酶降解，细菌分裂过程可重启[43]。因此，SOS丝状形变的关键调控因子是SulA蛋白。

细菌的染色体复制完成后，细菌进入分裂阶段。分裂过程中关键步骤的突变可阻止细菌进入正常生长过程，可能导致丝状及其他形变。分裂蛋白FtsZ是中板形成的核心蛋白，能招募下游的其他蛋白形成分裂复合物来完成二分裂。研究发现，胞内FtsZ蛋白的浓度至关重要。FtsZ低表达或缺陷导致细菌分裂受阻，发生丝状形变；而FtsZ高表达则会导致“小细胞”产生。研究表明，分裂复合物中蛋白的协调作用也非常重要，整个过程需要准确的调控[44]。FtsZ/FtsA蛋白的浓度比发生异常会阻断细菌的正常分裂，形成丝状细菌[45-47]。其他分裂复合物蛋白发生突变或异常也可能导致细菌的(长)丝状形变[48-49]。

细胞分裂的第二个关键步骤是细菌细胞壁的合成和分离。Miller等报道，细胞壁合成过程受阻时，细菌发生丝状形变[50]。Jiang 等使用理论模型来描述细胞壁生长与细胞骨架细丝在塑造细菌细胞形状过程中的相互作用，证明了细菌中细胞骨架蛋白MreB控制细胞形态并确定细胞呈球形还是棒状，缺失MreB的生长细胞表现出有利于向球形细胞发展的不稳定性，MreB可机械加固细胞壁并防止不稳定的发生。该模型证实有和没有MreB的形态变换是可逆的，并定量描述了不规则形状的细胞生长模式和正在经历分裂的细胞生长模式[51]。

3 细菌丝状形变的生物学及临床意义

现有研究提示，细菌丝状形变是其一种生存策略。细菌在营养缺陷[52]、放射性污染[35,37]、被宿主免疫系统攻击[53-54]及临床抗生素处理[50,55]等条件下，均会产生丝状形变，相关基础与应用研究是现代微生物学研究的焦点之一[56]。

3.1 营养缺陷

细菌在艰难的环境中“夹缝求生”，对其生存最大的威胁就是单一或多种营养的缺失，在这种情况下细菌经常以丝状形变来应对。细菌丝状形变增加了单个细菌的表面积，提高了细菌的吸收和吸附能力[57]。例如，链球菌细胞壁合成需维生素B6，维生素B6突变株呈丝状生长[58]。在消耗型营养缺失的条件下，DNA合成底物缺少，导致染色质受损，细菌诱导出SOS反应，出现丝状生长[59]。

3.2 紫外线照射

细菌受到紫外线照射时，会产生DNA损伤[36]，DNA损伤诱导SOS反应，阻断细菌分裂发生，导致细菌丝状生长[35]。丝状细菌中发生的DNA修复及修复过程中产生的突变，均能提高细菌在不利环境中生存的可能性，提示丝状形变的产生可能是细菌应对放射性污染的重要机制。

3.3 逃逸宿主免疫系统

病原体进入机体后，受到人体免疫系统细胞和因子的攻击。研究表明，细菌可能通过丝状形变来应对免疫系统的压力[54]。2004年，Justice等报道了尿道致病性大肠埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli，UPEC)感染表面膀胱上皮细胞，胞内感染的UPEC可从杆状变成长丝状，并从上皮细胞中逃离出来，成为感染周边细胞的主力军[60]。逃离出来的长丝状细菌可抵抗宿主免疫细胞的吞噬，在大肠埃希菌的致病性中起关键作用[61]。UPEC长丝状形成的机制是受SulA蛋白调控，但诱因尚未明确[54]。其他研究表明，免疫细胞中释放的一氧化氮(nitric oxide，NO)可能是细菌在宿主细胞中出现长丝状生长的一个原因。NO可导致细菌基因组断裂，引起DNA损伤，从而诱导SOS反应[53]，使细菌获得生存的机会。

细菌以丝状形变应对宿主免疫攻击的策略也被用于应对天然捕食者。研究发现，四膜虫只能捕食短于15 μm的细菌。当四膜虫以液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)为食物时，中间长度的细菌(2～10 μm)被捕食5 h后占比从46%减少为0；>30 μm的细菌占比从4%上升至50%[62]。同样的长丝状形变也在弯杆菌属(Flectobacillusspp.)被赭球虫(Ochromonassp.)捕食时出现[63]。在自然环境中，细菌被捕食时出现丝状形变的机制尚不清楚。

3.4 长丝状形变与耐药

目前临床面临着非常严峻的耐药问题。研究表明，细菌通过丝状形变可获得耐药性或降低对抗生素的敏感度。

环丙沙星和喹诺酮类抗生素通过作用于DNA拓扑异构酶来抑制细菌染色体的复制[64]。在高剂量抗生素作用下，98%的细菌被杀死，留下一小部分长丝状生长的细菌[65]。低剂量时，基本上所有细菌呈长丝状生长状态，并伴随着耐药突变体的出现[66]。2015年，Bos等发现在最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为 0.125 mg/L 的环丙沙星处理下，细菌发生了丝状形变，并观察到丝状菌顶端发生了不对称分裂，产生了单细菌。与初始细菌相比，通过过滤分离得到的单细菌的耐药菌比率增加了250倍[66]。研究发现，喹诺酮类抗生素通过阻断染色体复制引发SOS反应，导致细菌丝状形变的发生[67]。Cirz等通过在细菌中表达不能被降解的LexA蛋白，抑制细菌SOS反应，阻断了耐药菌的出现[68]。结果提示，细菌的耐药性可能是通过SOS丝状细菌中DNA损伤修复机制获得的。

此外，在某些β-内酰胺类抗生素处理下，细菌会出现一群停止生长或保持低速率生长的亚群，该亚群对抗生素的敏感度下降[69]。2004年，Miller等证明氨苄西林通过DpiBA双信号系统介导细菌的丝状生长，并进化出耐药的非遗传性突变[50]。氨苄西林通过抑制细胞壁合成干扰细菌分裂而导致长丝状形态，细菌生长缓慢甚至不生长，可提高细菌存活率。

在以上不适合细菌生长的情况下，细菌可能通过SOS反应触发细菌中DNA损伤修复机制(这是一种准确性差的修复方式，在修复的同时可抑制细胞分裂，细胞只生长但不复制)，获得更多的修复时间，以致发生丝状形变并同时产生高频度的基因变异。对细菌来说，这个条件既可是致命的，也可是置之死地而后生的，例如细菌耐药性很有可能由此获得。自然环境中细菌被捕食时出现丝状形变的机制尚不清楚，提示需对细菌出现丝状形变及细菌自我保护机制进一步研究，这对解决细菌耐药性、寻找新的抗菌药物或抑制细菌生长的新的作用靶点均具有重要意义。