H19和E2F1在子宫内膜癌中的表达及临床意义

薛玲玲，马会峰

河南科技大学第一附属医院1妇科，2产科，河南 洛阳 471000

子宫内膜癌（endometrial carinoma，EC）是临床常见的生殖系统恶性肿瘤，发病率较高，以围绝经期和绝经后女性多见[1]。EC的发病部位较隐匿，早期症状不明显，大部分患者确诊时已为中晚期。手术治疗能够提高早期EC患者的远期生存率，但其对于大部分中晚期EC患者特别是发生淋巴结转移的中晚期EC患者的效果较差，患者复发率高，预后不良。因此，寻找EC的早期诊断和预后监测指标是提高EC患者生存率的关键[2-3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA片段，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等多种生物学过程。H19属于lncRNA，lncRNAH19在不同肿瘤中通过不同的途径发挥着致癌基因或抑癌基因的作用。E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）是由人类E2F1基因编码的蛋白质，是E2F转录因子家族中的重要成员，在多种恶性肿瘤中均过表达[4-5]。目前，关于H19与E2F1在EC患者EC组织中的表达情况及相关性的研究较少。本研究探讨H19和E2F1在EC患者EC组织中的表达情况及临床意义，旨在为EC的早期诊治提供新的思路，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2012年3月至2013年3月河南科技大学第一附属医院的64例EC患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为原发子宫内膜癌；②术前未接受过放疗及化疗等抗肿瘤治疗；③国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期[6]为Ⅰ～Ⅳ期；④依从性良好；⑤拟接受手术治疗。排除标准：①年龄＜20岁；②近期服用过激素类药物；③合并其他子宫疾病；④合并其他部位恶性肿瘤；⑤合并系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病；⑥合并严重的心、肺、肾等其他脏器功能障碍；⑦合并精神类疾病和认知功能障碍。64例EC患者的年龄为35～78岁，平均年龄为（54.36±4.18）岁；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期24例；分化程度：高分化17例，中分化35例，低分化12例；组织学分级：G1级31例，G2级20例，G3级13例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移43例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有研究对象及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。收集64例EC患者术中切除的EC组织及相应的癌旁组织石蜡标本，用无菌焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水洗去血液，置入去RNA酶离心管中，液氮中保存备用。将所有样品快速冷冻于液氮中保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol试剂、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和反转录试剂盒均购自日本Takara公司，E2F1鼠抗人单克隆抗体、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）及免疫组化SP显色试剂盒均由上海科敏生物科技有限公司提供。7500 FAST型qRT-PCR仪购自美国ABI公司，MyCycler PCR仪购自美国Bio-Rad公司，紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher公司，紫外凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司。引物由上海Genepharma公司合成。

1.3 H19和E2F1相对表达量检测

取50 mg组织样本于液氮中研磨成粉末，迅速置于1.5 ml离心管中，加入100 ml Trizol试剂，严格按照试剂盒说明书的步骤从EC及癌旁组织中提取总RNA，采用紫外分光光度计检测其浓度及纯度，在260 nm和280 nm处测量吸光度值，计算两者的比值，两者比值为1.8～2.0方可用于合成cDNA。所有操作按照反转录试剂盒说明书进行。冰浴中配制20µl反应体系，包括5×Primer Script Buffer 4 µl，反应液10 µl，Primer Script RT Enzyme Mix 1 µl，RT Primer 2 µl，RNase-free ddH2O 3 µl。反应条件：95 ℃1 min，42 ℃15 min，85 ℃5 s；合成cDNA置于-20℃保持备用。PCR的总反应体系为20 µl，包括 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 µl，cDNA 2 µl，上游引物1.6 µl，下游引物1.6 µl，RNasefree ddH2O 4.8 µl。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，65℃3 s，60℃30 s；共进行40个循环。以GAPDH为内参基因进行PCR扩增，采用2-△△Ct公式计算EC组织及癌旁组织中H19和E2F1的相对表达量。H19的上游引物为5'-TGATGACGGGTGGAGGGGCTA-3'，下游引物为5'-TGATGTCGCCCTGTCTGCACG-3'；E2F1的上游引物为5'-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3'，下游引物为5'-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3'；内参GAPDH的上游引物为5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物为5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。实验重复3次。

1.4 E2F1蛋白检测

采用免疫组化SP法检测EC组织及癌旁组织中E2F1蛋白的表达情况，用已知EC组织阳性切片作阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，严格按照试剂盒说明书进行检测。E2F1蛋白以细胞核呈棕黄色为阳性，根据阳性细胞所占比例和染色强度判断染色结果。随机选取高倍镜（×200）下的10个不重复视野进行观察，每个视野计数50个细胞，计算阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，阳性细胞所占比例≤10%为1分，10%＜阳性细胞所占比例≤50%为2分，50%＜阳性细胞所占比例≤80%为3分，80%＜阳性细胞所占比例≤100%为4分。染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。两项评分相乘为总分，总分≤4分为E2F1蛋白表达阴性，总分＞4分为E2F1蛋白表达阳性。

1.5 随访

采用电话随访的方式对所有EC患者随访5年，每个月随访1次，随访截止时间为2018年3月31日，记录随访期间患者的生存情况。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson法进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中H19和E2F1相对表达量的比较

qRT-PCR检测结果显示，H19在EC组织中的相对表达量为（2.91±0.73），明显高于癌旁组织的（1.32±0.38），差异有统计学意义（t=18.360，P＜0.01）。E2F1在EC组织中的相对表达量为（1.73±0.49），明显高于癌旁组织的（0.65±0.15），差异有统计学意义（t=15.810，P＜0.01）。

2.2 不同组织中E2F1蛋白阳性表达情况的比较

免疫组化SP法检测结果显示，E2F1蛋白在EC组织中的阳性表达率为67.19%（43/64），明显高于癌旁组织的7.81%（5/64），差异有统计学意义（χ2=48.133，P＜0.01）。（图1）

图1 免疫组化法检测E2F1蛋白在EC 组织中的表达情况（SP染色，×200）

2.3 不同临床特征EC患者EC组织中H19、E2F1表达情况的比较

以EC患者EC组织中H19相对表达量的中位数（2.31）、E2F1相对表达量的中位数（1.28）为临界值，将64例EC患者分为H19高表达（H19相对表达量＞2.31）患者30例和H19低表达（H19相对表达量≤2.31）患者34例，E2F1高表达（E2F1相对表达量＞1.28）患者28例和E2F1低表达患者36例（E2F1相对表达量≤1.28）。不同年龄、分化程度、FIGO分期EC患者EC组织中H19的高表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同组织学分级、淋巴结转移情况EC患者EC组织中H19的高表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=6.357、10.787，P＜0.05）。不同年龄EC患者EC组织中E2F1的高表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同FIGO分期、分化程度、组织学分级、淋巴结转移情况EC患者EC组织中E2F1的高表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=5.486、7.156、7.591、17.578，P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征EC患者EC组织中H19、E2F1的表达情况

2.4 EC组织中H19和E2F1表达的相关性分析

对EC患者EC组织中H19和E2F1表达的相关性进行Pearson相关性分析，结果显示，H19和E2F1在EC患者EC组织中的表达呈正相关（r=0.750，P＜0.01）。

2.5 H19、E2F1表达与EC患者预后的关系

截至随访结束，64例EC患者中，生存31例，死亡33例。H19高表达的EC患者的5年生存率为33.33%（10/30），低于H19低表达的EC患者的61.76%（21/34），差异有统计学意义（χ2=4.451，P=0.035）。E2F1高表达患者的5年生存率为32.14%（9/28），低于E2F1低表达患者的61.11%（22/36），差异有统计学意义（χ2=5.432，P=0.020）。

3 讨论

EC是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，随着人们生活水平的提高，其发病率逐渐上升，术后复发率升高，且发病年龄呈现年轻化趋势，严重威胁女性的健康与生命[7]。遗传、绝经情况、雌激素情况、病理学诊断和影像技术等多种因素与EC的发生、发展有关[8]。因此，需要对EC的致病机制进行深入的研究，以寻找新的预后标志物为EC患者提供最佳的治疗和随访。

lncRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，主要在表观遗传学修饰、转录及转录后修饰方面调控基因的表达。研究发现，lncRNA在多种肿瘤中均有表达，能够通过上调或下调其在肿瘤组织中的表达，调控下游靶基因的表达，从而发挥促癌基因或抑癌基因的作用，该类基因可作为肿瘤生物标志物[9]。多种lncRNA在EC的发生过程中均发挥着重要的作用，如HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是个已知的、通过反式作用调节基因表达的lncRNA。王明娟等[10]研究发现，HOTAIR在EC患者的EC组织中高表达，并与EC细胞的增殖、侵袭和迁移能力均有关。lncRNAANRIL是lncRNA的一种，在多种恶性肿瘤中发挥着致癌基因的作用。殷悦等[11]研究发现，ANRIL在EC患者的EC组织中的相对表达量较高，且与EC的病理分级可能有关，可作为早期EC的辅助诊断指标。H19是首个被发现与肿瘤有关的lncRNA，具有促进肿瘤生长和抑制肿瘤生长的双重功能，在多种肿瘤尤其是在转移性肿瘤中高表达，具有较强的致癌活性[12]。Zhu等[13]研究发现，经RNA干扰后的H19可抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭，促进卵巢癌细胞的凋亡，可能能够作为卵巢癌治疗的靶点。本研究结果显示，H19在EC组织中的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），与Zhao等[14]的研究结果基本一致，提示H19在EC患者EC组织中的相对表达量较高，可能参与卵巢癌的发生与发展。E2F1是细胞周期相关转录因子E2F家族成员之一，且具有多种功能，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。王宏坤等[15]研究发现，E2F1在乳腺癌组织中的阳性表达率较高，可作为乳腺癌预后评估的指标。杨秀华和武昕[16]研究发现，E2F1在外阴鳞状细胞癌组织中的阳性表达率较高，不同肿瘤分期外阴鳞状细胞癌患者外阴鳞状细胞癌组织中E2F1的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示E2F1可能参与外阴鳞状细胞癌的发生、发展。本研究结果显示，E2F1在EC组织中的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），与Mints等[17]的研究结果基本一致，提示EC患者组织中E2F1的表达上调。本研究进一步分析了H19和E2F1的表达与EC患者临床特征的关系，结果显示，H19的高表达情况与EC患者的年龄、分化程度、FIGO分期可能无关，与组织学分级、淋巴结转移情况可能有关；E2F1的高表达情况与EC患者的年龄可能无关，与EC患者的FIGO分期、分化程度、组织学分级、淋巴结转移情况可能有关，提示H19、E2F1参与EC的发生与发展。另外，本研究通过相关性分析发现，EC患者EC组织中H19和E2F1的表达呈正相关（r=0.750，P＜0.01），提示二者可能通过相互协同作用参与EC的发生。有研究发现，H19能够通过竞争性结合miRNA-29a-3p调节E2F1的表达，而且E2F1能够通过调控下游靶基因p53突变体参与EC的发生，因此，H19和E2F1可能存在共同的信号通路，在参与EC的发生与发展过程中起着一定的协同作用[18-19]。本研究结果还显示，H19和E2F1低表达的EC患者的生存情况分别优于H19和E2F1高表达的EC患者（P＜0.05），提示H19、E2F1的表达与EC患者的预后有关，可作为评估EC预后的指标之一。

综上所述，H19和E2F1在EC患者EC组织中的表达上调，可能与EC患者的某些临床特征有关，且二者的表达水平呈正相关；此外，H19和E2F1高表达患者的预后较差。因此，H19和E2F1可能成为EC发生和预后的潜在预测指标。但本研究的不足之处在于纳入的样本量不足，因此，在后续的研究中将进一步补充临床资料、扩大样本量，深入研究H19和E2F1在EC中的作用，以进一步阐明EC发生、发展的潜在分子机制。