SEMA3B、AEG1蛋白在食管癌组织中的表达及临床意义

贾建博，辛向兵，朱爱林，韩勇，王涛

空军军医大学第二附属医院胸腔外科，西安 710038

食管癌患者的预后较差，其整体病死率较高[1]。随着病情持续性进展，食管癌患者的生存时间明显缩短，5年生存率明显下降[2]。基础方面的研究显示，信号素3B（semaphorin 3B，SEMA3B）蛋白表达上调时，能够通过抑制下游肿瘤细胞转录基因的激活，降低肿瘤细胞内炎症信号通路的激活程度，最终降低肿瘤细胞异常增殖的风险[3]。星型细胞上调基因 1（astrosyte elevated gene 1，AEG1）属于转录调控基因，其可以对肿瘤细胞的核DNA分裂进行调控，进而促进肿瘤干细胞的持续性自我增殖[4]。本研究对食管癌组织中SEMA3B、AEG1蛋白的表达情况进行分析，并对上述指标与食管癌患者临床特征的关系进行探讨，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2018年4月于空军军医大学第二附属医院接受治疗的120例食管癌患者。纳入标准：①年龄＜79岁；②经食管镜取活组织诊断为食管癌，且术后经病理学检查证实为食管癌；③无放化疗及免疫治疗史。排除标准：转移性食管癌。本研究共纳入食管癌患者120例，其中，男67例，女53例；年龄45～72岁，平均（57.0±7.6）岁；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期61例，Ⅲ期23例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化30例，中分化58例，低分化32例；浸润深度：T1～249例，T3～471例；有淋巴结转移67例，无淋巴结转移53例；病理类型：鳞状细胞癌106例，其他14例。收集120例食管癌患者的食管癌组织标本和对应癌旁组织标本。本研究符合《赫尔辛基宣言》相关医学伦理规定，经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 免疫组化染色法检测不同组织中SEMA3B、AEG1蛋白表达

取食管癌组织和癌旁组织标本，采用石蜡切片，脱水操作后采用3%H2O2于室温条件下孵育20 min；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次5 min；随后采用山羊血清封闭抗体5 min，倒去血清后不清洗，加入SEMA3B、AEG1一抗（浓度：1∶1000）5 ml，37 ℃孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；加入生物素荧光标记的二抗（浓度：1∶12 000）3 ml，37 ℃孵育 20～30 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入链霉亲合素/辣根过氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）标记的链霉卵白素，37 ℃孵育20～30 min，PBS清洗 3次，每次5 min；采用增强型HRP-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物显色试剂盒显色，自来水冲洗，复染，封片。

1.3 免疫组化染色法结果判定标准

SEMA3B蛋白主要表达于细胞质，AEG1蛋白主要表达于细胞质和细胞膜，两者阳性着色均呈黄色、棕黄色、褐色颗粒。根据着色强度评分：0分，无色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，褐色或黑色。根据阳性细胞所占比例评分：阳性细胞所占比例≤10%计1分，阳性细胞所占比例为11%～50%计2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计3分，阳性细胞所占比例＞75%计4分。将着色强度和阳性细胞所占比例评分相乘，总分＜3分判定为蛋白阴性表达，≥3分判定为蛋白阳性表达。

1.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测不同组织中SEMA3B、AEG1蛋白表达

采用冰上组织机械研磨的方法收集食管癌组织细胞，每10 g食管癌组织加入5 ml细胞裂解液，1500 r/min离心15 min，收集上清液；随后加入二喹啉甲酸检测蛋白浓度，按照检测蛋白与缓冲液1∶5的比例进行煮沸，以每孔50 μg蛋白上样，进行电泳、封闭和转膜，加入 SEMA3B、AEG1抗体（1∶800），4℃下过夜孵育，去除相关液体后采用TBST清洗3次，每次5 min；加入SEMA3B、AEG1二抗（1∶1500），TBST清洗3次，每次5 min，进行显影剂显影。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色法检测不同组织中SEMA3B、AEG1蛋白的表达情况

免疫组化染色法检测结果显示，食管癌组织中SEMA3B蛋白的阳性表达率为39.2%（47/120），明显低于癌旁组织的70.0%（84/120），差异有统计学意义（χ2=23.010，P＜0.01）；食管癌组织中AEG1蛋白的阳性表达率为75.8%（91/120），明显高于癌旁组织的28.3%（34/120），差异有统计学意义（χ2=54.244，P＜0.01）。

2.2 Western blot 法检测不同组织中SEMA3B、AEG1蛋白的表达情况

Western blot法检测结果显示，食管癌组织中SEMA3B蛋白的相对表达量明显低于癌旁组织，AEG1蛋白的相对表达量明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 食管癌组织及癌旁组织中SEMA3B、AEG1蛋白相对表达量的比较（±s）

表1 食管癌组织及癌旁组织中SEMA3B、AEG1蛋白相对表达量的比较（±s）

组织类型SEMA3B蛋白AEG1蛋白食管癌组织（n=120）癌旁组织（n=120）t值P值0.771±0.160 1.302±0.271 18.483 0.000 1.631±0.280 0.583±0.140 36.672 0.000

2.3 食管癌组织中SEMA3B、AEG1蛋白表达与食管癌患者临床特征的关系

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移食管癌患者食管癌组织中SEMA3B蛋白的阳性表达率分别低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=5.480、9.634，P＜0.05）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移食管癌患者食管癌组织中AEG1蛋白的阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为高中分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=6.224、7.643、15.589，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征食管癌患者食管癌组织中SEMA3B、AEG1蛋白的阳性表达情况

3 讨论

食管黏膜上皮细胞在长期损伤修复的过程中，部分癌基因突变或癌基因诱导的肿瘤细胞异常分裂，能够促进食管癌的病情进展。在长期吸烟、高温饮食或过度饮酒的人群中，食管癌的发病率明显增高[5]。已有研究表明，部分地区食管癌的发病率可超过845/10万，同时在合并有相关家族史的群体中，食管癌的发生风险明显增高[6-8]。本研究对食管癌患者食管癌组织中SEMA3B、AEG1蛋白的表达情况进行分析，并对SEMA3B、AEG1蛋白表达与患者临床特征的关系进行探讨，以期为临床食管癌患者的诊疗提供参考。

SEMA3B是信号素调控因子，能够通过与肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白受体相结合，拮抗肿瘤细胞中第二信使的激活，阻断肿瘤细胞中丝裂原激活蛋 白 激 酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）及p16信号通路。分子生物学领域的研究认为，SEMA3B还能够抑制癌基因的激活，提高细胞对错配基因的修复能力；AEG1是细胞转录调控因子，其可以通过激活转录启动子或增强子，上调肿瘤细胞结构蛋白的表达，进而提高肿瘤细胞的自我增殖速度[9-10]。一项探讨了SEMA3B在食管癌患者中表达情况的研究发现，相比于良性食管病变组织，食管癌患者食管癌组织中SEMA3B蛋白的阳性表达率明显降低，但该研究对食管癌组织中AEG1表达情况的分析尚不足[11]。

本研究结果显示，食管癌组织中SEMA3B蛋白的阳性表达率明显低于癌旁组织，而AEG1蛋白的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示SEMA3B、AEG1蛋白异常表达可能与食管癌的发生有关。SEMA3B蛋白的表达水平降低，导致其对肿瘤细胞膜结构蛋白的稳定作用被削减，肿瘤细胞内不同信号通路受体被异常激活，从而促进恶性肿瘤的发生；AEG1蛋白表达水平增高，能够提高肿瘤细胞转录开放阅读区的开放程度，进而影响肿瘤细胞的转录过程。张道省[12]研究表明，食管癌组织中AEG1蛋白的阳性表达率随食管癌患者的病情严重程度逐渐增高；患者的临床预后越差，AEG1蛋白的阳性表达率越高。本研究结果显示，食管癌组织中SEMA3B蛋白的相对表达量明显低于癌旁组织，而AEG1蛋白的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），提示在食管癌患者中同样存在明显的SEMA3B、AEG1的差异性表达。本研究结果还显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移食管癌患者食管癌组织中SEMA3B蛋白的阳性表达率分别低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者（P＜0.05），提示SEMA3B蛋白可能参与了食管癌的病情进展过程，究其原因可能为SEMA3B蛋白表达下调，能够影响食管癌细胞对深肌层及淋巴结组织的浸润能力；本研究还发现，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移食管癌患者食管癌组织中AEG1蛋白的阳性表达率分别高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为高中分化、无淋巴结转移的患者（P＜0.05），表明AEG1蛋白表达与食管癌患者的病情进展密切相关。

综上所述，食管癌患者食管癌组织中SEMA3B蛋白表达明显下调，而AEG1蛋白表达明显上调，且SEMA3B、AEG1蛋白表达与食管癌患者的临床特征有关。希望后续研究能够探讨SEMA3B、AEG1蛋白的表达与食管癌患者临床预后的关系。