CPEB4在透明细胞性肾细胞癌中的表达及临床意义

王静，王书芹，周梅，毕超，吕辉，禤瑞霞，汪芸，包贵贤

中山市中医院病理科，广东 中山 528400

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其最常见的病理类型为透明细胞性肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。近年来，RCC的发病率呈逐年上升且年轻化趋势[1]，严重威胁人们的健康与生命。目前，临床上主要以根治性肾切除术为主要治疗方案，但是由于大部分RCC患者早期缺乏典型的临床症状，确诊时已进展至中晚期，错过了手术的最佳时机；此外，RCC对放化疗的敏感性较差[2-3]。目前，临床上对于ccRCC的治疗仍然缺乏有效的手段，患者预后较差，因此，寻找新的潜在靶点一直是RCC治疗领域探讨的重点。胞质型多聚腺苷酸化元件结合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，CPEB4）是具有特异性RNA结合序列的胞质型多聚腺苷酸化元件结合蛋白（cytoplasmic polyadenylation element binding protein，CPEB）家族成员之一，与丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）/胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路有关，近年来，已引起细胞生物学家的广泛关注[4]。有研究显示，CPEB4对不同肿瘤细胞恶性生物学行为的调控机制不甚相同，在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中高表达，而在非小细胞肺癌和肝癌组织中低表达[5-6]，但目前关于CPEB4在ccRCC患者ccRCC组织中的表达情况及其与患者临床特征的关系尚未见明确报道。本研究通过分析ccRCC患者的79例ccRCC组织和32例癌旁正常组织中CPEB4的表达情况及其临床意义，旨在为ccRCC的诊断、治疗及预后评价提供新的思路和潜在靶点。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年8月至2016年7月中山市中医院收治的ccRCC患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为原发性ccRCC；②行根治性肾切除术前未接受过放化疗或新辅助治疗等抗肿瘤治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并糖尿病、高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病，以及肾脏、肝脏、肺脏疾病等严重的原发性基础病变；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并血液和免疫系统疾病。根据纳入、排除标准，本研究共纳入76例ccRCC患者，其中，男47例，女29例；年龄为26～81岁，平均年龄为（59.78±10.36）岁；根据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）制定的肾癌TNM分期标准[7]对患者进行TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期19例；根据世界卫生组织（WHO）组织学分级标准[8]对患者进行组织学分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级23例，Ⅲ级34例；左侧肾病变患者41例，右侧肾病变患者35例。收集76例ccRCC患者的ccRCC组织及其中32例患者的癌旁（距肿瘤外缘≥5 cm）正常组织石蜡包埋标本进行研究。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol购自美国Invitrogen公司；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购自北京OMEGA生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；兔抗人CPEB4抗体购自美国Abcam公司。Eppendorf 5427R型高速台式冷冻离心机和各种型号的移液器均购自德国Eppendorf公司；CX41倒置光学显微镜购自日本OLYMPUS公司；电子分析天平购自中国上海玉研科学仪器有限公司；恒温水浴摇床和YCZ-40D型转移电泳槽均购自北京六一仪器厂；实时定量PCR仪和GelDoc XR System凝胶成像数码分析系统均购自美国Bio-Rad公司；HWA-50D恒温水浴锅购自韩国Autonics公司；UV-8000紫外分光光度计购自上海精密仪器仪表公司。

1.3 观察指标

检测不同组织中CPEB4mRNA和蛋白的阳性表达情况，分析ccRCC组织中CPEB4mRNA和蛋白的阳性表达情况与患者临床特征及预后的关系，分析ccRCC患者预后的影响因素。

1.4 免疫组织化学染色法检测不同组织中CPEB4蛋白的表达情况及结果判定

严格按照试剂盒说明书的操作进行，具体步骤：①按照病理编号调出病理科存档的ccRCC组织和癌旁正常组织标本，常规石蜡包埋并连续切片，脱蜡、水化，将切片平铺置于载玻片上，烘干48 h后待用；②加热修复抗原；③灭活内源性过氧化物酶；④封闭；⑤加入 50 μl CPEB4一抗（1∶500稀释），4℃孵育过夜；⑥加入50 μl山羊抗兔二抗，室温孵育30 min；⑦滴加DAB试剂显色；⑧苏木精复染，常规脱水、透明和封片。在染色后的病理切片中，由2位以上经验丰富的病理科医师在高倍镜（×400）下随机选择每张切片中的10个不重复视野进行阅片。采用半定量计分法计算ccRCC细胞的染色强度和阳性细胞所占比例。CPEB4蛋白主要表达于细胞质和细胞核内。根据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例为0计0分，阳性细胞所占比例≤25%计1分，阳性细胞所占比例为26%～50%计2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计3分，阳性细胞所占比例＞75%计4分。根据细胞的染色强度进行评分：未染色计0分，弱染色计1分，中度染色计2分，强染色计3分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘得最终总分：1～3分为低表达，4～12分为高表达。

1.5 实时荧光定量PCR 检测不同组织中CPEB4 mRNA 的表达情况及结果判定

组织DNA提取：按照病理编号调出病理科存档的石蜡包埋组织切片，脱蜡水化后，切片，取100 mg组织置于EP管中；加入Trizol试剂提取总RNA，加入20μl焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解沉淀，分装，置于-80℃保存备用。采用凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测RNA分子量及浓度。逆转录反应：取5 μl RNA样本置于PCR管中，70℃恒温水浴锅中静置5 min，冰浴静置1 min，加入20 μl逆转录试剂，混匀后离心。置于PCR仪中，设定25℃10 min，37℃60 min；将反应产物置于-80℃保存备用。采用实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法检测不同组织中CPEB4mRNA的表达情况，将25 μl反应体系（Taq Mix 22 μl+cDNA 模板 1 μl+上下游引物各 1 μl）按照PCR程序进行扩增；反应条件：95℃ 3 min预变性；95℃ 30 s变性，60℃30 s退火（β-actin、CPEB4的退火温度分别为60℃、57.8℃），72℃5 min延伸；共循环40次。β-actin的上游引物为5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'，下游引物为5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；长度为334 bp。CPEB4的上游引物为5'-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3'，下游引物为5'-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3'；长度为273 bp。根据实时定量PCR仪的使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。基于Ct值，采用2-△△Ct法计算CPEB4mRNA的相对表达量。CPEB4mRNA的相对表达量≥Ct平均值则判定为阳性表达，否则为阴性表达。

1.6 随访

采用邮件、电话、信件及门诊就诊的方式对全部患者进行随访。术后2年内每3个月随访1次，后每6个月随访1次；随访时间为6～50个月，终点事件为患者死亡。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示；采用Cox比例风险模型分析ccRCC患者预后的影响因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ccRCC 组织和癌旁正常组织中CPEB4 mRNA及蛋白表达情况的比较

免疫组化染色结果显示，ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4蛋白的高表达率为57.89%（44/76），明显高于癌旁正常组织中CPEB4蛋白的28.12%（9/32），差异有统计学意义（χ2=7.985，P＜0.01）。RT-PCR法检测结果显示，ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA的阳性表达率为56.58%（43/76），明显高于癌旁正常组织的18.75%（6/32），差异有统计学意义（χ2=13.001，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA 阳性表达情况的比较

不同年龄、性别、肿瘤部位的ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同TNM分期、WHO组织学分级和淋巴结转移情况的ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4 mRNA阳性表达情况的比较（n=76）

2.3 ccRCC组织中CPEB4mRNA表达与ccRCC患者预后的关系

截至随访结束，ccRCC患者的3年生存率为59.21%（45/76），其中，CPEB4mRNA阴性表达患者的3年生存率为60.61%（20/33），明显高于CPEB4mRNA阳性表达患者的58.14%（25/43），差异有统计学意义（χ2=7.012，P＜0.01）。

2.4 ccRCC 患者预后的影响因素分析

Cox比例风险模型分析结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA阳性表达是ccRCC患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表2）

表2 ccRCC患者预后影响因素的Cox比例风险回归分析（n=76）

3 讨论

RCC是一类起源于肾实质泌尿小管上皮细胞的恶性肿瘤，约80%的患者为ccRCC患者，以根治性肾切除术为主要治疗方式[9]。但是，部分ccRCC患者早期缺乏典型的临床表现，确诊时已错过手术的最佳时机。ccRCC对放化疗不敏感，且部分ccRCC患者手术后会复发；对于此部分患者，目前尚缺乏有效的治疗方案[10]。由于RCC具有高度的遗传异质性，涉及多种基因的突变或缺失，因此，寻找新的基因靶点是目前肾癌治疗领域关注的重点[11]。

CPEB具有高度保守的特异性RNA识别序列，可促进多聚腺苷酸化诱导的翻译过程，与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤血管生成等病理生理过程密切相关[12]。CPEB家族包含CPEB1、CPEB2、CPEB3、CPEB4 4个成员，各成员可单独或相互作用，从而参与调控肿瘤的发生、发展[13]。其中，CPEB4是poly（A）尾延伸和聚腺苷酸化诱导翻译的关键因子，在多种肿瘤细胞中呈高表达；通过与Ras信号通路中的相关分子、染色质重塑相关蛋白、细胞周期蛋白、凋亡相关分子、压力和炎性相关因子、代谢酶及侵袭转移相关基因等结合，在肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、凋亡等生物学行为中发挥着重要作用[14]。有研究显示，CPEB4通过与两个以上的胞质聚腺苷酸化物结合，作为致癌因子参与多种肿瘤的发生、发展以及血管生成，并与大量癌基因或抑癌基因密切相关[15]。但是，在非小细胞肺癌和肝癌中，CPEB4的作用恰恰相反。国外有研究显示，敲除CPEB4基因后，肝癌荷瘤小鼠的成瘤能力和肿瘤生长活性增强[16]；而且肝癌或非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中CPEB4的表达水平明显低于相应的癌旁正常组织中CPEB4的表达水平，且与患者的肿瘤分期呈负相关；提示CPEB4在肝癌和非小细胞肺癌的发生、发展过程中可能作为抑癌分子发挥作用[17]。目前关于CPEB4在ccRCC组织中的表达情况及其与患者病理特征关系的研究相对较少。

本研究通过RT-PCR和免疫组织化学染色法检测了76例ccRCC患者的ccRCC组织和其中的32例ccRCC患者相应的癌旁正常组织中CPEB4的表达情况，结果显示，ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4蛋白的高表达率明显高于癌旁正常组织，CPEB4mRNA的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）；ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA的阳性表达率可能与患者的年龄、性别、肿瘤部位均无关，可能与患者的TNM分期、WHO组织学分级和淋巴结转移情况均有关。提示CPEB4可能参与ccRCC的发生、发展。另外，本研究又进一步分析了ccRCC患者ccRCC组织中CPEB4mRNA的表达与ccRCC患者预后的关系，结果发现，CPEB4mRNA阴性表达患者的3年生存率明显低于CPEB4mRNA阳性表达患者（P＜0.01）；Cox比例风险模型分析结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA阳性表达是ccRCC患者预后的独立危险因素（P＜0.05），均提示CPEB4的表达水平越高，TNM分期越高，ccRCC患者的预后越差。

综上所述，CPEB4mRNA和蛋白在ccRCC患者ccRCC组织中的表达水平较高，与ccRCC的发生、发展密切相关；此外，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA阳性表达的ccRCC患者的预后较差，对于指导ccRCC的临床治疗具有一定的参考价值。但是由于本研究纳入的样本量少，且关于CPEB4在ccRCC发生、发展中的作用机制尚不明确，因此，CPEB4是否可作为ccRCC患者预后的辅助评估指标用于临床尚需要大量研究验证。