点篮子鱼染色体核型分析

周剑光，王妤，王昱斌，张林，张涛，邹雄，刘鉴毅

（1.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部水产品质量安全风险评估实验室（武汉），湖北 武汉 430223；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

点篮子鱼（Siganus guttatus Bloch，1787）隶属于鲈形目Perciformes、刺尾鱼亚目Acanthuroidei、篮子鱼科Siganidae、篮子鱼属Siganus，是一种杂食、广盐的暖水性鱼类，主要分布于热带亚热带的印度西太平洋及我国南海海域[1]。我国对篮子鱼的研究主要集中在形态特征[2-4]、摄食与生长[5]、人工繁殖[6]、肌肉营养成分分析[7]等方面。长鳍篮子鱼S.canaliculatus、褐篮子鱼S.fuscescens、爪哇篮子鱼S.javus、蠕纹篮子鱼S.vermiculatus、黑篮子鱼S.spinus 的染色体组型已有报道[8-12]，而对点篮子鱼染色体核型的研究尚未见报道。本文通过腹腔注射植物血球凝集素（PHA）和秋水仙素，取肾脏细胞空气干燥制片，首次研究并报道了点篮子鱼的染色体组型，以补充篮子鱼科的细胞遗传学基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验鱼

用于制备染色体的24 尾（9 雌15 雄）点篮子鱼为中国水产科学研究院东海水产研究所琼海研究中心人工繁殖的苗种，体质量在100～200 g。实验用鱼于2018 年5 月9 日空运至中国水产科学研究院长江水产研究所种质实验室，先用1%的人工海水在1.0m×0.6m×0.8m 的玻璃钢盆中暂养一周，水温控制在20～25℃，待实验鱼适应环境后即开始实验。

1.1.2 仪器与试剂

主要仪器与试剂包括Olympus IX 81 倒置荧光显微镜系统（Olympus 公司，Japan）、植物血球凝集素（PHA，源叶生物公司）、秋水仙素（Urchem 公司）和吉姆萨（Giemsa）染色液（Solarbio 公司）等。

1.2 方法

1.2.1 染色体标本制备

参考周剑光等[13]的方法并稍作修改：（1）注射PHA 和秋水仙素：向实验鱼腹腔注射PHA，剂量为10～15μg·g-1（鱼体质量）；24h 后，腹腔注射秋水仙素，剂量为1.0～6.0μg·g-1（鱼体质量）；（2）制备细胞悬液，注射秋水仙素1.5～5.0h 后，剪开实验鱼的鳃部动脉放血20min，取出肾组织用0.85%生理盐水洗涤3～4 次，将组织剪碎、过滤细胞悬液，再放入离心管中，以1 000r·min-1离心10min（以下同），得到沉淀的点篮子鱼肾细胞；（3）低渗和固定，往离心管中的沉淀细胞加入6mL 的0.075mol·L-1的KCl 低渗液，低渗50～60min；随后滴加0.5mL 预冷新配的卡诺氏固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1，以下同），预固定3～4min 后离心10min；量取4mL 固定液加入到刚弃去上清液的沉淀细胞中，用吸管吹打均匀，固定20min 后再离心10min；再重复固定2 次，每次20min；（4）滴片与染色，将细胞悬液滴于预冷载玻片上，并在酒精灯上过火2～3 次后放置通风干燥处自然风干；用15%吉姆萨（Giemsa）染色液将风干的染色体玻片染色35min，用蒸馏水冲洗玻片，自然风干后镜检。

1.2.2 染色体众数确定及核型分析

参照TAN 等[14]方法稍加修改，方法如下：

（1）众数确定

对24 尾（9 雌15 雄）点篮子鱼的120 个分散良好、清晰的染色体中期细胞，用Olympus IX 81 倒置荧光显微镜系统进行观察、拍照并统计染色体数目，根据众数确定点篮子鱼二倍体染色体数。

（2）核型分析

选取10 个数目完整、形态清晰、分散度良好、长度适中（正中期）、着丝点清楚、2 条染色单体适度分开的分裂相，用Photoshop CC 软件分别测量每一条染色体的长臂和短臂，数据取平均值。计算其相对长度、臂比值和着丝粒指数，并按Levan 等[15]提出的标准进行配对、分类并排列核型。染色体相对长度、臂比值和着丝粒指数的计算公式：染色体相对长度=（染色体长度/染色体组总长度）×100%；染色体臂比=长臂长度/短臂长度；着丝粒指数=（短臂长度/该染色体总长度）×100。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理剂量、温度与时间的效果

设计20℃、23℃和25℃下不同秋水仙素剂量及处理时间的8 组染色体标本制备实验。发现在20℃时，不同秋水仙素剂量及不同处理时间获得的染色体分裂相均极少，当剂量为4.0～6.0μg·g-1（鱼体质量），处理时间为5.0h，获得的染色体呈短粗型，染色体臂收缩严重，着丝点位置不清晰；当剂量为1.5～2.5μg·g-1（鱼体质量），处理时间为4.0h，获得的染色体短粗型和狭长型均有，核型较好。温度25℃时，当秋水仙素剂量为2.0～2.5μg·g-1（鱼体质量），处理时间为3.0～4.0h，获得的染色体分裂相多，但染色体形态多样，短粗型较多，狭长型较少；当剂量为1.0～1.5μg·g-1（鱼体质量），处理时间为2.5～3.0h，获得的染色体分裂相多，染色体狭长型，sm 组（亚中部着丝点染色体，r（臂比）＝1.71～3.00）和st 组（亚端部着丝点染色体，r＝3.01～7.00）染色体长短臂清晰，着丝点位置易辨（表1）。

表1 不同温度下秋水仙素注射量及处理时间染色体标本的制备效果比较Tab.1 Comparison of preparation of chromosome specimen in golden rabbitfish,Siganus guttatus exposed to different injection volume and treatment periods of colchicine at different temperatures

2.2 点篮子鱼染色体数目

对肾细胞空气干燥制片法制备的24 尾（9 雌15 雄）点篮子鱼染色体标本进行了显微观察并拍照，统计了120 染色体中期分裂相的数目，结果见表2。由表2 可知，染色体数目为48 的细胞数有87个，占72.50%，由此确定点篮子鱼的染色体众数为2n=48（图1 A）。

2.3 点篮子鱼的染色体核型

点篮子鱼染色体的核型数据统计结果见表3。按Levan 等[15]命名法，点篮子鱼全部48 条染色体可分成3 组。9 号和14 号共2 对染色体r＝2.35～2.89范围内，属亚中部着丝点染色体sm 组；1、2、3、5 和7 号共5 对染色体r＝3.70～4.53 范围内，属亚端部着丝点染色体st 组；其余17 对染色体r＞7.0，属端部着丝点染色体t 组。因此，点篮子鱼的核型公式为2n＝4sm+10st+34t，臂数（NF）＝52。点篮子鱼染色体相对长度最长为（5.91±0.20）%，而最短为（2.36±0.34）%。按相对长度排列，制成点篮子鱼染色体核型图（图1B）。由图1 B 可知，点篮子鱼的5对st 组染色体相对较大，而2 对sm 组染色体相对较小。未发现带有随体、次缢痕的染色体和异形性染色体。

表2 点篮子鱼二倍体染色体数目计数Tab.2 Counts of the diploid chromosome in golden rabbitfish,Siganus guttatus

表3 点篮子鱼染色体核型数据Tab.3 The karyotypic data of chromosomes in golden rabbitfish,Siganus guttatus（n=10;x±SD）

图1 点篮子鱼染色体中期分裂相图谱（A）及核型（B）Fig.1 The metaphase chromosome（A）and karyotype（B）in golden rabbitfish,Siganus guttatus

3 讨论

染色体与核型分析对研究鱼类遗传和进化具有重要意义。淡水鱼类染色体核型的研究已有大量报道和专著出版[16]，但是海水鱼类染色体核型的研究报道相对较少。截至2019 年，参考卓孝磊等[17]及作者本人的统计，中国已经进行染色体研究的海水鱼类约有113 种（鲈形目82 种），分属7 个目35科，约占我国近3100 种海水鱼类的3.65%；染色体数目2n=48 的占多数，约87 种，占总数的77.0%。

赵金良[18]指出，海水鱼类染色体形态以端部、亚端部着丝粒染色体较多，而中部、亚中部着丝粒染色体较少。目前已报道染色体核型的篮子鱼共5种（表4），其中长鳍篮子鱼S.canaliculatus、爪哇篮子鱼S.javus 的染色体数目为48，核型公式为2n=48t（NF=48），均为端部染色体；褐篮子鱼S.fuscescens、蠕纹篮子鱼S.vermiculatus 的染色体数目也为48，核型公式为2n=2a+46t（NF=50），有1 对近端着丝粒染色体和23 对端部染色体；黑篮子鱼S.spinus 的染色体数目为42，核型公式为2n=6m+36t（NF=48），有3 对中部染色体和18 对端部染色体;而本文报道的点篮子鱼的染色体数为48，核型公式为2n=4sm+10st+34t（NF=52），有2 对亚中部染色体、5 对亚端部染色体和17 对端部染色体。除黑篮子鱼的染色体数目为42 外，其余5 种篮子鱼的染色体数目均为48，但核型公式和染色体臂数存在区别。杨慧一[19]的报道，秋水仙素浓度和处理时间两种因素均可使染色体产生不同程度的收缩，导致研究结果偏差。由于制片方法不当，sm 和st 型染色体有时着丝点不易区分，易与t 型染色体混淆。6 种篮子鱼的染色体核型公式和染色体臂数存在区别的原因是否也与秋水仙素剂量和处理时间不同有关还有待进一步研究。

表4 篮子鱼科（鲈形目）中鱼类的细胞遗传学检验。Tab.4 Cytogenetic reviews of fishes in family Siganidae（Perciformes）

小岛吉雄[20]对800 余种已作核型研究的鱼类染色体进行研究，将真骨鱼类划分为低位类、中位类和高位类3 个演化类群。研究结果发现：进化上越处于上位，染色体越收敛，端着丝粒染色体多，臂数少，在鱼类系统演化上属高位类，染色体数在2n=42～48 的范围内，峰值是2n=48，m 型染色体（包括m 和sm 染色体）少，a 型染色体（包括st 和t染色体）多。点篮子鱼的染色体数目为2n=48，核型公式为2n=4sm+10st+34t，m 型染色体数目为4，a 型染色体数目为44，NF=52，为典型的高位类群染色体数目。因此，点篮子鱼在鱼类系统演化上属高位类群。

李树深[21]研究发现，利用着丝粒染色体和臂数数目可以划分不同鱼类类群，具有较多的端部着丝粒染色体的鱼类属于原始类群，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体的鱼类则属于特化类群，染色体臂数多的类群较之臂数少的类群更为特化。由表4 可知，点篮子鱼的染色体臂数较其他篮子鱼染色体臂数多，且具有较多亚中部着丝粒染色体，推测点篮子鱼可能是篮子鱼科中较晚分化出来的，在进化上属于较为特化的类群。