饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼生长和免疫的影响

石和荣，何琪，吕晴霁，彭激夫，梁添发，陈奕彬，柳小春，杨宇晴，刘苏，张海发，王庆，赵会宏

（1.广东省海洋渔业试验中心，广东 惠州 516081；2.华南农业大学海洋学院，广东 广州 510640；3.广东天地本草饲料科技有限公司，广东 中山 528400）

虎龙杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）生长快、成活率高、肉质鲜美人工养殖得到了快速发展[1]。但随着石斑鱼养殖业集约化养殖规模的扩大，近海污染严重，养殖过程中疾病频发，抗生素或化学药物的滥用等对环境和人类健康产生了不良影响，严重制约了石斑鱼养殖业的发展[2]。

中草药是一种天然绿色饲料添加剂，包含生物碱、多糖、有机酸、挥发油等多种活性成分[3]。近年来，研究发现黄芪Astragalus membranaceus、板蓝根Baphicacanthus cusia、金银花Lonicera japonica 等多种中草药能不同程度地提高水产动物的免疫力及生长性能[4,5]。如李华等[6]研究发现，投喂一定量的牛膝等中草药可显著提高大菱鲆Scophthalmus maximus 的免疫力。核苷酸被称为条件营养物质，当动物体内源核苷酸合成不足时，需要来源于饲料的外源核苷酸加以补充，是一种新型绿色饲料添加剂[7]。目前，饲料中添加核苷酸对奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.areus）[8]、大菱鲆[9]等养殖鱼类生长及免疫的影响已有报道。大多数研究表明：饲料中添加核苷酸能进水产动物的生长发育，提高其免疫力。虎龙杂交斑是近年推广的水产养殖石斑鱼品种，关于中草药或核苷酸对其作用效果报道较少。

本试验通过研究在饲料中添加一种复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼生长及免疫功能的影响，以期为探索虎龙杂交斑循环水养殖中的病害防控技术，提高石斑鱼循环水养殖的存活率和抗病力，以及探究水产动物的高效养殖提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

石斑鱼基础料（RUBY 牌）委托广东越群饲料公司定制（表1）；复合中草药添加剂由板蓝根、黄岑、黄芪、忍冬藤、白芷、甘草共6 种中草药按比例为1∶1∶1∶1∶1∶1 复配而成（由广东天地本草饲料科技有限公司提供），经中药粉末专用气旋筛粉机加工，细度达到300 目。核苷酸（瑞士CHEMOFORMA 公司提供）由纯化胞苷酸、纯化腺苷酸、纯化胸苷酸、纯化鸟苷酸、纯化鸟苷酸、纯化核糖核酸按等质量比例（1∶1∶1∶1∶1∶1）复配而成。添加剂先与粘合剂混匀（粘合剂为a-淀粉，两者比例为1∶0.2），然后在基础饲料中分别加入2 g/kg、4 g/kg复合中草药添加剂和4 g/kg 核苷酸添加剂，混合均匀，喷洒少量水雾，使其与饲料粘合，经小型制粒机制成粒径为3 mm 的颗粒型膨化饲料，风干后置于-4℃的冰箱中冷藏，保存备用。

表1 基础饲料组成和营养水平（风干基础）Tab.1 Ingredient and utrition level of basal feed（on airdry basis）

1.2 试验设计及试验管理

试验在广东省海洋渔业试验中心的室内循环水养殖系统中进行。试验开始前，将平均质量（22.36±0.07）g 的试验鱼饥饿24h，挑选由中心提供的600 尾大小均匀、健康的杂交石斑鱼放养于12个养殖桶中（有效养殖水体0.55 m3），每桶50 尾，随机分为4 组，每组设置3 个重复。驯化一周后开始正式试验。正式试验时，每天早上8:30 和下午4:30各饱食投喂1 次，摄食5min 后，在养殖桶或网内设置投料篮，收集残饵，记录残饵数量。每日记录各试验组投饵量、死亡率等，养殖周期为56 d。整个养殖过程中水温为27.05～31.05℃，溶解氧为5.40～7.70mg/L，pH 为7.50～8.20，氨氮浓度小于0.3mg/L。

1.3 样品采集与处理

采样前停喂24h，将养殖桶内的试验鱼全部捞出，统计尾数和试验鱼总质量。从每个养殖桶中随机选取20 尾鱼测量体质量、体长等生长性能指标。然后，用1.0mL 的注射器抽取尾静脉血液，注射于1.5mL 的离心管中，4 ℃下静置4h 后，以5 000r/min离心10min，取上层清液分装0.5mL 的离心管中，置于-80℃保存备用。用经过灭菌灭酶处理的采样工具按顺序解剖称量内脏和肝脏质量，并将其前肠与肝胰脏、脾脏、肾脏三个免疫器官分别放入2mL 离心管中于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱中备用。再将解剖后的鱼去皮取背部肌肉，于-80℃保存备用。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能的计算

1.4.2 肌肉常规检测

粗蛋白含量用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量用索氏抽提法测定。

1.4.3 血清生化指标

血清溶菌酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.4.4 mRNA 的相对表达量

采用荧光定量PCR 法测定虎龙杂交石斑鱼肝胰脏、脾、肾中干扰素γ（IFN-γ）、热休克蛋白70（HSP70）、白细胞介素β（IL-1β）相关基因的表达水平。用Magen 公司的Hipure Universal RNA Kits 试剂盒提取总RNA。用核酸浓度分析仪测定核酸溶液的A260/A280的比值即为核酸纯度，其范围在1.8～2.0之间，自动记录各浓度。用琼脂凝胶法检测RNA 的质量。提取1μg 样品RNA 后采用北京全式金生物技术有限公司的EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒（含去除基因组中残留DNA 步骤）进行逆转录，合成cDNA。应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，并在NCBI/Primer-BLAST 上进行比对，选择特异性引物。所设计引物序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR 引物序列见表2。以cDNA 为模板，采用荧光定量PCR 法，用北京全式金生物技术有限公司的TransScriptTip Green qPCR Super Mix 试剂盒测定肝胰腺、脾、肾、组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、γ-干扰素（IFN-γ）和热休克蛋白70（HSP70）免疫相关基因的相对表达水平。20 μL 的反应体系包括：10 μL 2×TransScriptTip Green qPCR Super Mix、0.4 μL Forward Primer（10 μM）、0.4 μL Reverse Primer（10 μM）、0.4 μL Passive Reference Dye（50х）、1 μL cDNA 和7.8 μL ddH2O。反应条件为：94℃30s、94℃5s、58℃15s、72℃10s，共40 个循环。每个样品做3 次分析。采用的2-△△CT法计算各目的基因mRNA 的相对表达量。

表2 荧光定量PCR 引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

所得数据用平均值±标准误（Mean±SE）表示，用Excel 2018 软件进行处理，通过SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）,并进行Duncan 多重比较，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼生长性能的影响

由表3 可知：添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼的体质量增重率、特定生长率无显著影响（P＞0.05），但显著提高了虎龙杂交石斑鱼的成活率（P＜0.05）；4g/kg 中草药组饲料系数显著低于2g/kg 中草药组（P＜0.05）；4g/kg 中草药组、4g/kg 核苷酸组肥满度和脏体比显著高于对照组（P＜0.05）；各组间虎龙杂交石斑鱼肝体比无显著差异（P＞0.05）。

2.2 添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼肌肉营养成分的影响

由表4 可知：添加复方中草药或核苷酸的处理组肌肉蛋白和脂肪含量与对照组无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼血清溶菌酶的影响

由表5 可知：添加复方中草药或核苷酸组鱼血清溶菌酶活性显著高于对照组（P＜0.05），其中4 g/kg 核苷酸组最高。

2.4 添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼免疫相关基因表达的影响

饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼免疫相关基因表达的影响见图1、图2 和图3。添加复方中草药或核苷酸的饲料总体上提高了虎龙杂交石斑鱼3 个器官细胞因子的mRNA 表达。2g/kg 中草药组肾脏中HSP70、IL-1β 及脾脏中IFN-γ 表达量显著高于对照组（P＜0.05），4g/kg 中草药组肝中IL-1β 表达量显著高于对照组和其他试验组（P＜0.05）；肾脏和脾脏中IFN-γ 表达量显著高于对照组（P＜0.05），4g/kg 核苷酸组脾中HSP70和IL-1β 表达量显著高于对照组和其他试验组（P＜0.05）；脾的IFN-γ 表达量显著高于对照组（P＜0.05）。

表3 饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼生长性能的影响Tab.3 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on growth performance of hybrid grouper

表4 饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼肌肉营养成分的影响Tab.4 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on muscular proximate composition of hybrid grouper

图1 饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼HSP-70 表达的影响Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine and nucleotides on the expression of HSP-70 in hybrid grouper

图2 饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼IL-1β 表达的影响Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IL-1β in hybrid grouper

图3 饲料中添加复方中草药或核苷酸对虎龙杂交石斑鱼IFN-γ 表达的影响Fig.3 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IFN-γ in hybrid grouper

3 讨论

3.1 添加复方中草药对虎龙杂交石斑鱼的影响

3.1.1 生长性能

本试验中，在饲料中添加含有板蓝根、黄芪、黄岑等的复方中草药，虎龙杂交石斑鱼的体质量增重率和特定生长率增加不明显，但复方中药的添加量为4g/kg 时，饲料系数降低了5.2%，存活率也显著增加。这说明，饲料中添加适量的复方中草药或核苷酸能在维持虎龙杂交石斑鱼正常生长的同时，又大大增强了其抗病能力。徐安乐等[10]研究发现，在饲料中添加含有大黄、金银花和黄芪等的复方中草药，对珍珠龙胆石斑鱼（E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀）的促生长效果不显著，仅降低了饵料系数。而吴彬等[11]以含有0.5%黄芩、0.5%金银花、0.5%板蓝根、0.5%黄芪等氮等能饲料分别投喂吉富罗非鱼Oreochromis niloticus 幼鱼发现，各组鱼体增重、特定生长率显著提高，饲料系数显著降低，其中黄芪组各项生长指标显著高于其他实验组。马国红等[12]探究了板蓝根、黄芪、甘草等对鲤Cyprinus carpio 生长性能及其体成分的影响，认为适宜添加复方中草药可以促进鱼类生长，降低饲料系数。综上所述，饲料中添加适量的中草药能不同程度地促进水产动物生长，而给药剂量不同，可能与添加中草药种类和养殖对象的不同有关。中草药中含有的多糖类、有机酸、生物碱、黄酮类能增加动物体内红细胞数量，促进机体血红蛋白、血清总蛋白的合成。中草药可影响水产动物胃肠道内常在菌群的状态，维护动物肠道健康，优化肠道对营养成分的吸收，促进水产动物的健康生长[3]。

3.1.2 免疫能力

溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要来源于吞噬细胞，能破环细菌、真菌、病毒以及寄生物结构，显著增强鱼体的抗病能力。溶菌酶活性的高低直接显示溶菌作用的强弱，可以代表机体免疫功能的状况[13]。研究发现[14]，黄芪、黄岑中含有多糖、生物碱等营养成分，能有效促进相关免疫酶的合成。中草药可提高水产动物血液中溶菌酶活性的研究报道屡见不鲜。李华等[6]以牛膝、板蓝根、甘草等中草药制成免疫增强剂投喂大菱鲆Scophthalmus maximus，显著提高了其溶菌酶活性。李梅芳[15]等选用黄芪、黄岑等中草药投喂大黄鱼Pseudosciaena crocea，各组鱼溶菌酶活性显著上升，这与本研究结论相似。但在本试验中，随着复方中草药含量的增加，溶菌酶活性有所减少，其原因可能与使用剂量有关，复方中草药超过一定用量后是否会抑制血清溶菌酶的活性，有待下一步试验探索。

相关研究表明：复方中草药中的某些物质能诱导免疫相关基因的表达。IL-1β 作为IL 家族重要的一员，是最早表达的一个炎性细胞因子，它能诱导淋巴细胞的生长以及分泌一些细胞因子来增强免疫应答，杀灭病原，起到抗细菌、病毒、肿瘤的作用[16]。一定量的黄芪、板蓝根、蒲公英等中药多糖对IL-1β 的表达具有调节作用[17]。在哺乳动物中，IFN 可以分为α、β、γ 三种类型，三者均有抗病毒活性。其中，IFN-γ 为Ⅱ型对干扰素是一个单基因家族，在免疫调节以及炎症反应中起重要作用。HSP70 是热休克蛋白家族最重要和保守的蛋白，扮演着细胞因子和分子伴侣的双层身份。很多研究报道，HSP70 具有多种生物学活性和功能，包括分子伴侣、免疫调节、抗氧化、提高机体耐受力、对细胞周期的调节等功能[18]。帅学宏等[19]研究发现，青蒿多糖提高了小鼠血清中IL-1β 和IFN-γ 质量浓度。王家敏[20]研究发现，黄芪、当归等复方中草药能诱导吉富罗非鱼Hsp70 和IL-1β 基因在头肾、肝脏、胸腺、鳃和脾脏组织中表达。本试验结果证实了在饲料中添加复方中草药诱导虎龙杂交石斑鱼IL-1β、IFN-γ、HSP70 三种免疫相关基因在肾脏、脾脏组织中的合成与分泌。

3.2 添加核苷酸对虎龙杂交石斑鱼的影响

3.2.1 生长性能

核苷酸是动物体内不可缺少的重要部分，它广泛参与动物体内供能、脂肪代谢等生命过程，提供鱼体快速生长时细胞复制所需的核苷酸，可增强代谢酶活性，促进动物生长、提高饲料利用率等[21]。本试验结果表明，饲料中添加4 g/kg 的核苷酸，对虎龙杂交石斑鱼的增重率、特定生长率、饲料系数无显著性影响。与对照组相比，质量增重率、特定生长率分别增加7.24%和4.06%，且存活率显著增加。韩春梅等[8]和Lin 等[22]研究发现，饲料中添加一定量的核苷酸能显著促进奥尼罗非鱼幼鱼和点带石斑鱼Epinephelus malabaricus 的生长，但是各种试验结果也不尽一致。Safar 等[23]发现，在饲料中添加核苷酸对细长爪鳌虾Astacus leptodctylus 的促生长作用不明显。在本试验中，添加外源核苷酸没有显著促进虎龙杂交石斑鱼的增重率和特定生长率，但较对照组略有增加。成活率的显著性增加，说明一定量的核苷酸能有效增强虎龙杂交石斑鱼的免疫力。据推测，核苷酸在水产动物中促生长效果可能存在种系的差异。有关外源核苷酸对石斑鱼的生长性能研究报道较少，其作用机理尚不清楚，有待更深入的研究。

3.2.2 免疫能力

向枭等[24]研究发现，在饲料中添加519.85～774.00 mg/kg 核苷酸能提高鲤血清溶菌酶活性；曹俊明等[25]研究表明，饲料中添加0.8 g/kg 外源核苷酸可显著提高凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 血清中溶菌酶活性，增强非特异性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。本研究表明，饲料中添加4 g/kg 核苷酸对虎龙杂交石斑鱼血清溶菌酶活性虽无显著影响，但与对照组相比增加了38.38%。这是否与试验鱼种、饲料组成、试验条件、核苷酸的剂量及剂型不同有关，还需要进一步研究。本试验发现，投喂核苷酸能诱导IL-1β、IFN-γ 和HSP70 三种免疫相关基因在虎龙杂交石斑鱼肾脏、脾脏组织中的合成与分泌，这与Reda 等[26]的研究结果相一致。目前，关于外源核苷酸影响机体非特异性免疫功能的机理还不清楚，究其原因可能是参加免疫的大部分细胞合成的核苷酸不能满足所需，影响了吞噬细胞和白细胞等的增殖、分化和活力以及红细胞的数目。

3.3 结论

基础饲料中添加复方中草药或核苷酸可维持虎龙杂交石斑鱼的正常生长，显著提高其成活率（P＜0.05）；其中4g/kg 中草药饲料系数显著低于2g/kg 中草药组（P＜0.05）；4g/kg 中草药、4g/kg 核苷酸能显著增加鱼体肥满度和脏体比（P＜0.05）；4g/kg 复方中草药、2g/kg 中草药或4g/kg 核苷酸能增强虎龙杂交石斑鱼肾脏、脾脏中IL-1β、IFN-γ、HSP70 免疫相关基因的表达，其中，2g/kg 中草药添加剂的增强效果更明显。综上所述，2g/kg、4g/kg 的复方中草药添加量能有效促进虎龙杂交石斑鱼生长，具有一定的增强免疫效果。