甲醛对鲫血清抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

任海，张诺，华智杰，梅静，梁俊平，李雪冬

（1.河北科技师范学院动物科技学院，河北 昌黎 066600；2.河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007；3.秦皇岛市国家级水产种质资源保护区管理处，河北 秦皇岛 066000）

甲醛（HCHO）是一种具有强烈刺激性气味的气体，易溶入水，通常将40%的甲醛水溶液称为福尔马林。甲醛能与机体内的蛋白质发生反应，还能与细胞质结合而杀灭细菌、寄生虫、真菌、芽孢和病毒等，是水产养殖中常用的化学药物[1]，尤其是寄生虫疾病的防治中。甲醛毒性强，副作用较大，对鱼类有明显的负面影响，表现为：不安乱窜，浮头，鳃损伤，身体侧翻失去平衡，甚至死亡[2]。

甲醛治疗鱼类寄生虫病时，对机体抗氧化系统机能的影响尚未见报道。鱼类具有完善的抗氧化系统，用于抵御外界氧化胁迫因子产生的活性氧自由基[3]。当体内活性氧自由基量增加时，机体的抗氧化系统相应抗氧化酶的活性受到影响[4]。抗氧化酶活力的变化在一定程度上能反映鱼类在不同环境条件下的生理状况，可作为衡量鱼类是否受到外界环境胁迫的重要生理指标，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化酶类在免疫调节中发挥重要的作用[5-7]，而丙二醛（MDA）作为机体脂质过氧化作用的终产物，其含量高低可间接反映机体的脂质过氧化水平以及生物细胞受活性氧自由基攻击的程度[8]。本研究通过测定用不同浓度甲醛处理后鲫Carassius auratus 血清中SOD、CAT、GSH 活力和MDA 含量变化，以探讨鲫抗氧化系统对甲醛胁迫后的响应。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鲫购自昌黎县碣阳湖，平均体质量为（500±25）g，暂养一周后，选规格相近、无病无伤的健康个体进行试验。

主要仪器：水族箱（70cm×20cm×30cm）、电子天平、台式高速离心机、恒温水浴锅、酶标仪等。

主要试剂：甲醛（分析纯，含量为40.0%）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量的试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

试验用水为充分曝气的自来水，pH 为（7.0±0.2），温度为（20±2）℃。鲫随机分为对照组（不添加甲醛）和试验组，每组设3 个平行，每个平行4 尾。将甲醛溶液于1 000mL 烧杯中稀释后泼洒到水族箱内，使箱内水体中甲醛终浓度为50mg/L 和100mg/L。试验期间持续充氧，观察鲫的活力。泼洒甲醛后1h、3h 和6h 随机从每个鱼缸内捞取1 尾鱼，尾静脉采血，合并3 尾鱼血液于1.5mL 离心管中，4℃冰箱放置6h 后3 000r/min（4℃）离心10min，收集血清，保存在-20℃冰箱中备用。

CAT、SOD 和GSH 活性及MDA 含量按照南京建成生物工程研究所试剂盒的说明书进行测定。每min 分解1μmol 的过氧化氢即为1 个酶活力单位（U）。每mg 组织蛋白在1mL 反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD 量为1 个SOD 活力单位（U）；用5，5'-二硫代硝基苯甲酸（DTNB）比色法测定GSH 活性；采用TBA 法测定MDA 含量。

1.3 数据分析

所有指标测定均重复3 次，试验数据用Microsoft Excel 2003 处理后，用平均值±标准差（mean±SD）表示，利用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），经Duncan's 检验法进行统计分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甲醛对鲫血清SOD 活力的影响

由图1 可知，不同甲醛浓度（50mg/L 和100mg/L）浸泡鲫1～6h，随着甲醛胁迫时间的延长，试验组鲫血清中SOD 活力先升高后降低，在3h 达最大值，之后有所下降，但是，在整个过程中SOD 活力均显著高于对照组（P＜0.05）。

图1 甲醛对鲫血清SOD 活力的影响Fig.1 Effect of formaldehyde exposure on SOD activity in serum of crucian carp

2.2 甲醛对鲫血清CAT 活力的影响

由图2 可知，随着甲醛胁迫时间的延长，试验组鲫血清中CAT 活力先升高后下降，3h 达最大值。50mg/L 甲醛处理组1h 血清中CAT 活力显著低于对照组（P＜0.05）；而50mg/L 和100mg/L 甲醛处理组3h和6h 血清中CAT 活力均显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3 甲醛对鲫血清GSH 活性的影响

图2 甲醛对鲫血清CAT 活力的影响Fig.2 Effect of formaldehyde exposure on CAT activity in serum of crucian carp

图3 甲醛处理对鲫血清GSH 活力的影响Fig.3 Effects of formaldehyde exposure on GSH activity in serum of crucian carp

由图3 可知，不同浓度甲醛浸泡6h 后，随着甲醛处理时间的延长，鲫血清中GSH 活力先升高后降低，3h 时达最高值。50mg/L 和100mg/L 甲醛处理1h和6h 后，鲫血清中GSH 活力与对照组无显著性差异（P＞0.05）；而不同浓度甲醛处理组3h 血清中GSH活力均显著高于对照组（P＜0.05）。

2.4 甲醛对鲫血清MDA 含量的影响

由图4 可知，不同浓度甲醛浸泡6h 后，随着胁迫时间的延长，鲫血清中MDA 含量大致呈现先降低后升高的变化趋势，6h 达到最高值。1h 时50mg/L 甲醛处理组鲫血清中MDA 含量与对照组无显著性差异（P＞0.05），但是100mg/L 甲醛处理组MDA 含量显著高于对照组（P＜0.05）。3h 时50mg/L 甲醛组MDA含量显著低于对照组（P＜0.05），而100mg/L 甲醛组与对照组无显著性差异（P＞0.05），但是，50mg/L 和100mg/L 甲醛处理组在6h 均显著高于对照组（P＜0.05）。

图4 甲醛处理对鲫血清MDA 含量的影响Fig.4 Effect of formaldehyde treatment on MDA content in serum of crucian carp

3 讨论

甲醛能与蛋白质中氨基酸结合使蛋白质变性，起到杀灭各种生物的作用，已广泛用于水产养殖疾病防治中[9]。有研究认为，当机体受到外源性化学物质刺激时，会导致体内产生过多的活性氧自由基（ROS），而ROS 能够引起机体产生脂质过氧化损伤，进而发生细胞突变、DNA 损伤，严重时还会引起死亡。当机体发生损伤时，机体会产生一系列抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px和谷胱甘肽转移酶（Glutathionetransferase，GST）等来防止过氧化损伤的发生[10,11]。体内酶性抗氧化系统和非酶性抗氧化系统构成机体的抗氧化防御系统[12]。酶性抗氧化酶能够防止氧化代谢物对机体的损伤，这些酶除了可以相互保护，还能共同抵御外界胁迫因子产生的ROS 对机体的损伤[13]。当机体接触到有害物质时，随着接触时间的延长或者毒性增强，其抗氧化系统遭到破坏，部分抗氧化物质含量和酶活性降低，机体无法清除体内过量的自由基，导致机体氧化损伤，最终表现为脂质过氧化产物MDA 含量增加[14]。本试验用不同浓度甲醛药浴鲫后，测定血清中SOD、CAT、GSH 活性和MDA 含量，旨在明确甲醛在治疗疾病的同时对鱼体抗氧化系统的影响作用。

鱼类的非特异性免疫在应对逆环境应激中起主导作用，SOD、CAT 以及GPx 等抗氧化酶对清除机体氧化胁迫中产生的活性氧自由基起决定作用[15]，其中SOD 和CAT 的作用基本一致，共同清除体内过多的活性氧自由基，减少机体氧化损伤，是机体内重要的保护酶。SOD 是机体抗氧化防御系统的第一道防线，当体内活性氧增多时，SOD 首先发挥清除活性氧的功能，随后CAT 发挥作用，降低活性氧含量，保护机体免受损伤。本试验结果表明，血清中SOD和CAT 的变化趋势基本一致，均为先升高后降低的趋势。任海等[14]认为，上述变化趋势可能与SOD 和CAT 行使的功能有关。本试验中，上述两种酶在3～6h 均显著高于对照组（P＜0.05），其原因可能与体内过氧化损伤发生应激性增高有关。甲醛持续作用诱导鲫体内ROS 增加，机体反馈性增强抗氧化系统酶活力来对抗甲醛氧化损伤产生的过多ROS，这可能与毒物兴奋作用有关[16]。强俊等[17]在研究氨氮与拥挤胁迫对吉富品系尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus幼鱼肝脏抗氧化指标的影响中也发现，机体通过增加代谢来应对环境胁迫，氧自由基也随之增加，SOD与CAT 活力的增加被认为是生物体对新陈代谢的适应，能够减轻脂质过氧化物损伤。

GSH 作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物，是组织中主要的非蛋白质疏基化合物，可以使细胞含疏基的酶和蛋白质免受氧化损伤，在细胞抗ROS 损伤的解毒代谢中起着重要作用，在消除细胞中H2O2方面具有与CAT 相似的功能[18]。研究发现GSH 是机体抵御氧化损伤重要的酶，能够调节生物体内自由基浓度的平衡，保持细胞结构的完整，是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。本试验结果表明，随着甲醛胁迫时间的延长，GSH 活性呈现先升高后下降的变化趋势，不同浓度甲醛处理组均在3h 出现峰值，且低浓度甲醛组GSH 活性高于高浓度组，推测这种现象可能是由于低毒胁迫的诱导作用。王小娇等[19]研究表明：尼罗罗非鱼暴露在低浓度Cd 时，受Cd 胁迫而产生大量活性氧，应急系统被激活，GSH 含量随Cd 质量浓度的增大而升高。

MDA 是一种高活性脂质过氧化产物，可以衡量脂质过氧化程度，间接反映动物机体细胞受自由基攻击的的损伤程度，判定动物体的健康情况[20]。本试验结果表明，鲫血清中MDA 含量随着甲醛胁迫时间的延长而先降低后升高，3h 最低，6h 达最大值。其原因可能是甲醛胁迫使得组织中产生过多的活性氧，一方面机体通过提高自身的抗氧化酶活力如SOD、CAT 和GSH 等抗氧化酶来消除自由基，减弱脂质过氧化作用，最终表现为MDA 含量较低[21]；另一方面随着甲醛浓度增加和胁迫时间延长，在一定程度上超过了机体所承受的范围时，机体产生过量的活性氧对机体造成氧化损伤，破坏了细胞电子传递链、线粒体膜电位及ATP 能量产生，严重时引起机体细胞凋亡或坏死[22,23]。这也进一步提示，甲醛胁迫下MDA积累可能是甲醛对鲫产生毒害作用的主要原因之一。本研究中甲醛胁迫能否导致鲫细胞凋亡，需进一步实验验证。