大蒜根系分泌物分离、鉴定及其对烤烟的化感作用

吴晓婷， 常 悦， 赖荣泉∗， 陈志厚， 郭萍婷， 白晶晶

(1.福建农林大学植物保护学院， 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建 福州350002； 2.福建省烟草公司南平市公司， 福建 南平353000)

化感作用是指植物或微生物的代谢分泌物对环境中其它植物或微生物有利或不利的作用(吴晓华，2010)。 植物可通过释放化感物质来实现其化感作用，而化感物质的释放途径包括挥发、分泌、腐解、淋溶(王大力，1998；韩丽梅等，2002)和花粉直感(Jimenezet al，1983)等。 植物化感作用不仅对作物的轮作、间作、套作的合理安排有重大影响，而且可有效控制农作物病虫草害的发生(杨阳等，2013；李轩等，2013)。

目前大蒜被认为是良好的前茬作物，而大蒜根系分泌物是前茬影响后茬的主要物质，在农业间套作体系中应用非常普遍且效应良好(丁海燕，2017)。 张磊等(2015)研究大蒜根系分泌物对当归的化感作用时发现:随着大蒜浓度的提高，大蒜根系分泌物对当归种子的发芽势、发芽率和发芽指数均呈现出先增加后降低的促进提高作用。 刘素慧等(2011)发现含有大蒜根系分泌物的混合琼脂培养基对受体作物种子的萌芽和生长均有一定的抑制作用，而且随着分泌物比例的增大，抑制程度也越明显。 周艳丽等(2012)发现乙酸乙酯组分中所含的化感物质为:2，6-二异丙基苯酚、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫化物和邻苯二甲酸二丁酯。 李春龙(2018)发现化感物质香豆酸对豌豆种子萌发、幼苗根长和幼苗苗高等指标均表现出“低浓度促进、高浓度抑制”的效应。 赖荣泉等(2010)研究表明大蒜根系分泌物对烤烟幼苗有一定的抑制作用，对其成株无明显影响，但其主要成份对烤烟的化感作用未见报道。

因此研究大蒜根系分泌物，特别是其主要成份对烤烟的化感作用具有重大意义。 本试验通过收集大蒜根系分泌物，并分析其主要成份对烤烟K326 的种子萌发、幼苗生长及成株的生理指标的影响，来研究大蒜根系分泌物的化感作用，以期为大田利用大蒜间作、套种或连作等提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为大蒜(山东孝贤故里寻味鱼台生产紫皮蒜)、受体材料为“烤烟K326”(福建省烟草农业科学研究所南平分所提供)。

试剂:邻苯二甲酸二丁酯(99.5%，天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产)、2，6-二叔丁基对甲酚(99%，麦克林试剂制造有限公司生产)。

仪器:气相-质谱联用仪(Agilent 6890 B-5977 A，中国安捷伦科技有限公司生产)、智能光照培养箱(ZGX-300 C，中国杭州钱江仪器有限公司制造)、真空数种仪(ZL-2000 D，中国杭州钱江仪器有限公司制造)、叶绿素含量测定仪(A1RT-207，中国杭州钱江仪器有限公司生产)。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的获取 采用沙培、沙土培和水培3 种栽培方法对大蒜根系分泌物进行收集。

沙培:首先挑选大小均一蒜瓣，剥去外衣，用流水冲洗2 h，晾干。 将其播入装有2 cm 纯沙的塑料瓶中(高:8.2 cm；上直径:9 cm；下直径:8 cm)，每瓶5 瓣，以不种大蒜为对照，每个处理重复4 次，室内培养。 培养过程中每天下午5:00 加入8 mL 水以保证蒜瓣生长，40 d 后拔出，用蒸馏水淋洗根系，静置数分钟后过滤，即得到大蒜根系分泌物。

沙土培:将挑选好的大蒜播种到装有2 cm 沙土中(沙土比7 ∶3)，40 d 后拔出大蒜，用蒸馏水淋洗根系，静置数分钟后过滤，即得到大蒜根系分泌物。

水培:将挑选好的大蒜播种到装有2 cm 水中，用棉花固定，40 d 后拔出大蒜，用蒸馏水清洗根系，将大蒜更换到另一个塑料瓶中(直径约13 cm)，加入蒸馏水，5d 后收集培养液，所收集的培养液即为大蒜根系分泌物。

1.2.2 大蒜根系分泌物主要成份的测定 参照周艳丽(2007)方法并加以修改，采用萃取法将所得的根系分泌物用乙酸乙酯进行萃取，各取3 种收集方法大蒜根系分泌物3 mL，按乙酸乙酯∶分泌物体积比为2 ∶1 的比例萃取3 次，萃取后大蒜根系分泌物主要成份在下层液体中，然后将上述三种样品经无水硫酸钠干燥后，用气相-质谱联用仪测定其主要成份。

1.2.3 对烤烟种子发芽影响的测定 参照周艳丽(2007)方法:选取邻苯二甲酸二丁酯(本文测出，含量最高)和2，6-二叔丁基对甲酚(据报道使用最多)两种物质，分别称取0.1 g 的2，6-二叔丁基对甲酚和量取0.1 mL 的邻苯二甲酸二丁酯于两个100 mL 容量瓶中，用少量乙醇溶解后用蒸馏水定容，定容后的溶液为母液，将母液稀释为100、500、1 000 mg·L-1的溶液，以乙醇为对照，每个浓度重复三次。 先在培养皿(直径9 cm)中放两层定性滤纸，再用移液枪吸取各溶液9 mL 于培养皿中，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水9 mL，对照先加9 mL 乙醇，待挥发后加等量的蒸馏水，然后用真空数种仪数100 粒K326 烟草种子于培养皿中，放入培养箱中培养(温度:25 ℃，相对湿度:40.3%)，并于每天下午5:00 滴加蒸馏水3 mL，以保持滤纸湿润。于5 d 后，每天调查种子的发芽情况及数量，根据以下公式计算种子的发芽率、发芽指数、化感效应指数。 并于20 d 后，在每个培养皿中选取幼苗5 株，测定其根长、苗高、鲜重。

发芽率/%＝(置床后第7 d 正常发芽种子数/供试种子数)×100

发芽指数＝Σ(Gt/Dt)

式中:Gt为播种t日的发芽数；Dt为相应的发芽日数。

化感效应指数(RI):当T≥C时，RI＝1-C/T；当T＜C时，RI＝T/C-1

式中:C为发芽指数对照值，T为发芽指数处理值(RI＞0 为促进作用，RI＜0 为抑制作用，RI绝对值代表作用强度大小)

1.2.4 对烟株成苗生长影响的测定 采用漂浮育苗，播种45 d 后，选取长势均一幼苗移载置花盆中，每盆1 株，共24 盆，自然生长，每株烟株基部分别浇灌9 mL 浓度为100、500、1 000 mg·L-1的两种试剂，乙醇为对照，每个浓度三次重复，每隔3 d 浇灌一次，共浇灌3 次。10 d 后选取各烟株同一部位的烟叶测量叶绿素含量，并选取浓度为1 000 mg·L-1的烟株测根系活力大小(叶尚红，2004)。

1.3 数据分析

采用Excel 2010 与SPSS 19.0 对数据进行整理，进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 大蒜根系分泌物成份分析

采用沙培、沙土培和水培方法收集大蒜根系分泌物，用乙酸乙酯萃取后利用GC/MS 进行质谱扫描，图谱分别见图1～3，各成份相对含量见表1。

图1 沙培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯组分的GC/MS 鉴定图谱Figure 1 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in the sand culture of the garlic root exudates

图2 沙土培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯组分的GC/MS 鉴定图谱Figure 2 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in sand and soil culture of the garlic root exudates

图3 水培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯组分的GC/MS 鉴定图谱Figure 3 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in the water culture of the garlic root exudates

表1 大蒜根系分泌物中乙酸乙酯相成份Table 1 Allelochemicals of ethyl acetate fractions in the garlic root exudates

由图1 和表1 可知，沙培大蒜根系分泌物乙酸乙酯组分中的物质成份，按照百分含量由高到低依次为:邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯(正辛烷的4 位)、3，4-己烷二乙基、2-丁烯酸，4-硝基苯基酯。 由图2 和表1 可知，沙土培中的物质成份，按照百分含量由高到低依次为:邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯(正辛烷的4 位)、2，4-二(1，1-二甲基乙基)苯酚、1，2-苯二甲酸二异丁酯。 由图3 和表1 可知，水培中的物质成份，按照百分含量由高到低依次为:2，4-二(1，1-二甲基乙基)苯酚、1，2-苯二甲酸，丁基辛酯、1，2-苯二甲酸，丁基2-甲基丙基酯、邻苯二甲酸二丁酯。

2.2 大蒜根系分泌物主要成份对烤烟的化感作用

2.2.1 大蒜根系分泌物主要成份对烤烟种子发芽及幼苗生长的影响 本试验测出的大蒜根系分泌物主要成份与报道的有些差异(周艳丽等，2007；李春龙，2018)，因此，本次试验选择测出的主要成份邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚(经查阅文献，前人用此试剂去测定对萝卜种子等化感作用)来测定对烤烟K326 的化感作用。

用不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚处理烤烟种子，测量其发芽率以及幼苗的根长、苗高和鲜重，并计算化感作用效应，结果见图4 和表2。 由图4(a)可知随着试剂浓度的升高，烤烟种子的发芽率呈逐渐降低的趋势，用邻苯二甲酸二丁酯处理后的发芽率从90%下降至83%，用2，6-二叔丁基对甲酚处理后的发芽率从90.33%下降至85.33%，不同浓度的两种试剂对烟草种子的影响达到了显著水平(邻苯二甲酸二丁酯:F3，8＝5.447，P＝0.025；2，6-二叔丁基对甲酚:F3，8＝6.099，P＝0.018)。 由图4(b)可知，随着试剂浓度的升高，烤烟种子的苗高逐渐降低，用邻苯二甲酸二丁酯处理后的苗高从0.41 cm 下降至0.17 cm，用2，6-二叔丁基对甲酚处理后的苗高从0.51 cm 下降至0.22 cm，不同浓度的两种试剂对幼苗苗高的影响达到了显著水平(邻苯二甲酸二丁酯:F3，8＝162.110，P＝0.000；2，6-二叔丁基对甲酚:F3，8＝150.882，P＝0.000)。 由图4(c)可知随着试剂浓度的升高，烤烟种子的根长逐渐降低，用邻苯二甲酸二丁酯处理后的根长从0.46 cm 下降至0.11 cm，用2，6-二叔丁基对甲酚处理后的根长从0.57 cm 下降至0.11 cm，不同浓度的两种试剂对幼苗根长的影响达到了显著水平(邻苯二甲酸二丁酯:F3，8＝326.21，P＝0.000；2，6-二叔丁基对甲酚:F3，8＝343.494，P＝0.000)。 由图4(d)可知随着试剂浓度的升高，烤烟种子的鲜重逐渐降低，用邻苯二甲酸二丁酯处理后的鲜重从0.018 g 下降至0.015 g，用2，6-二叔丁基对甲酚处理后的鲜重从0.019 g 下降至0.017 g，不同浓度的两种试剂对幼苗鲜重的影响达到了显著水平(邻苯二甲酸二丁酯:F3，8＝37.333，P＝0.000；2，6-二叔丁基对甲酚:F3，8＝3.818，P＝0.058)。

图4 邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚对烤烟的影响Figure 4 Effects of dibutyl phthalate and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol on flue-cured tobacco

由表2 可知，在不同浓度邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚处理下，烤烟种子发芽指数均呈现逐渐下降的趋势，且浓度越大，发芽指数越小。 两种不同浓度试剂处理下，化感效应指数均小于0，且随着浓度的不断增加，绝对值也逐渐增加，当邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚浓度为1 000 mg·L-1时，化感效应指数分别为-0.10 和-0.07。

邻苯二甲酸二丁酯化感效应指数与浓度的线性回归方程为:Y＝-14.090X-0.047(X为邻苯二甲酸二丁酯不同浓度，Y为化感效应指数)，判定系数R2＝0.968，浓度与化感效应指数之间有一定的线性关系。 2，6-二叔丁基对甲酚化感效应指数与浓度的线性回归方程为:Y＝-14.090X-0.017(X为2，6-二叔丁基对甲酚不同浓度，Y为化感效应指数)，判定系数R2＝0.968，浓度与化感效应指数之间有一定的线性关系。

表2 邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚对烤烟的化感效应指数和发芽指数的影响Table 2 Effect of dibutyl phthalate and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol on allelopathic effect index and germination index of flue-cured tobacco

2.2.2 大蒜根系分泌物主要成份对成苗叶绿素和根系活力的影响 由表3 可知，随着邻苯二甲酸二丁酯浓度的升高，烤烟K326 成苗的叶绿素含量与对照相比总体表现为低浓度促进、高浓度抑制，但处理与对照之间差异不显著(F3，8＝0.770，P＝0.542)。 2，6-二叔丁基对甲酚各浓度处理下烤烟K326 成苗的叶绿素含量较对照均有所增加，但差异不显著(F3，8＝0.031，P＝0.992)。 当两种试剂浓度均为1 000 mg·L-1时，邻苯二甲酸二丁酯对烤烟成苗根系活力的抑制率为53%，2，6-二叔丁基对甲酚对烤烟成苗根系活力的抑制率为38%。

表3 化感物质对烤烟成苗叶绿素及根系活力的影响Table 2 Effects of allelochemicals on chlorophyll and root activity of flue-cured tobacco seedlings

3 结论与讨论

作物根系分泌物中含有多种化感物质成份，化感作用又与物种、品种及浓度有密切关系(王薇薇等，2018)。 周艳丽(2007)测出的大蒜根系分泌物的化感物质有2，6-二叔丁基对甲酚、2，6-二异丙基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫化物，本次试验只测出了邻苯二甲酸二丁酯，与周艳丽结果有差异，可能是由于大蒜品种不同或培养时间不同等原因造成的这一结果。 有研究表明:邻苯二甲酸二丁酯对黄瓜种子萌发及幼苗生长有显著促进作用(李轶修等，2009)。 赖荣泉等人(2010)研究发现:大蒜挥发物对烤烟种苗鲜物质的积累具有明显抑制作用，新鲜大蒜乙醇提取物对不同烤烟品种发芽具有较强的抑制作用，种过大蒜的土壤可抑制不同烤烟品种种苗鲜物质的积累，但大蒜提取物及种过大蒜的土壤对不同烤烟品种成苗无显著的抑制作用。 本次试验结果表明:随着大蒜根系分泌物中的化感物质浓度的升高，对烤烟K326 种子萌发以及幼苗的苗高、根长、鲜重均表现为降低，说明随着化感物质浓度的升高，其对K326 种子萌发以及幼苗的苗高、根长、鲜重抑制作用逐渐增强，但是对成苗烟株的叶绿素含量和根系活力没有显著的影响，抑制效果不明显，且邻苯二甲酸二丁酯对烤烟幼苗的苗高、根长和鲜重的降低趋势较2，6-二叔丁基对甲酚明显。 本试验得出的结论与赖荣泉等人(2010)的研究结果一致。 而黄翔杰等(2017)研究了2，4-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二乙酯两种化感物质对生菜鲜重、莴苣和油菜胚根生长的化感作用，并发现不同的化感物质对同一植物化感作用不同，而同一化感物质对不同植物的化感作用也不一定相同。

由于本试验中选取的两种化感物质不能完全代表大蒜根系分泌物主要成份，因此还需要进一步探讨、验证大蒜根系分泌物的其他主要成份对K326 的化感作用。