花生黄化病致病线虫的形态鉴定与分子生物学检测

廖琳琳， 刘国坤， 程 曦， 张绍升

(福建农林大学植物保护学院， 福建 福州350002)

装饰中环线虫(Mesocriconema ornata)是一种外寄生线虫，花生是装饰中环线虫的重要寄主作物(张绍升，1999)。 被侵染的花生植株，其根、荚果和果针上会形成褐色坏死斑。 少数伤痕时形成于表面，而坏死的大伤痕则可以深入到组织内。 大量的侧根原基和幼根被杀死，导致侧根数减少，使植株的地上部生长衰弱，叶色黄化。 美国的佐治亚州将此病称为“花生黄化病”( Lucet al，2005)。 目前已有研究发现，在福建省厦门市、福州市、莆田市的花生上分离出一种线虫，对该线虫形态进行测量和观察后将其鉴定为装饰中环线虫(章淑玲等，2012；李世通，2013)。

近年来，课题组在宁德市霞浦县的多个花生地块采集到黄化的花生病株，获得大量形态特征一致的环线虫。 本试验通过显微形态测量观察以及分子生物学测定，对这些花生黄花病致病线虫进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2013—2014 年，在宁德市霞浦县的花生产区发现花生黄化的现象，采集受害花生的根、荚果和根际土壤，并带回实验室作进一步检查。

1.2 线虫分离与病组织染色

利用改良贝曼漏斗法(张绍升，1999)对采回的花生植株的根系、荚果和根际土壤进行分离，通过病组织染色观察线虫的侵染状态，染色方法参考Bybdet al(1983)。

1.3 线虫标本制作与保存

将分离获得的线虫置于体视显微镜下，挑取成虫于凹玻片的水滴中，经酒精灯火焰温热杀死。 将杀死后的线虫挑到滴有TAF 固定液的载玻片上制成临时玻片，用于形态特征观察。 取部分线虫样本经脱水后制成永久玻片用于保存(张绍升，1999)。

1.4 线虫的分子生物学鉴定

1.4.1 线虫DNA 的提取 将单头雌虫挑于灭菌的dd H2O 中清洗3 遍。 取20 μL 的WLB 裂解液于200 μL 的PCR 管中，并加1 μL 蛋白酶K 溶液(1.2 mg·L-1)混匀(Williamset al，1992)。 挑取清洗过后的线虫于混合液中，用挑针压断线虫。 将其置于-20 ℃冰箱中过夜。 然后取出放在PCR 仪中65 ℃温育1 h，95 ℃10 min，降温至4 ℃后，将其作为模板加入到反应体系中扩增。

1.4.2 PCR 扩增 ITS 区扩增:引物为ITS1(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和ITS2(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)。 采用50 μL 反应体系:25 μL PCR Master Mixture、5 μL DNA 模板、2 μL ITS1 (10 mmol·L-1)、2 μL ITS2 (10 mmol·L-1)、16 μL ddH2O。 扩增程序:95 ℃预变性150 s；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环；72 ℃最后延伸600 s，于12 ℃保存。

D2D3 区扩增:引物为D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)。 采用50 μL 反应体系:25 μL PCR Master Mixture、5 μL DNA 模板、2 μL D2A (10 mmol·L-1)、2 μL D3B (10 mmol·L-1)、16 μL ddH2O。 扩增程序:94 ℃预变性240 s；94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共36 个循环；72 ℃最后延伸600 s，于4 ℃保存。

1.4.3 上样与琼脂糖凝胶电泳 反应结束后，将1%琼脂糖凝胶放置在电泳缓冲液为0.5×TBE的电泳槽中。 取5 μL 扩增产物、1 μL 6×loading buffer 和0.2 μL 的核酸染料混合，于凝胶孔中上样。 在电压100 V、电流40 mA 下电泳30 min。 电泳结束后，将凝胶放置在全自动凝胶成像仪中观察、拍照。

1.4.4 PCR 产物纯化、克隆和测序分析 PCR 产物送交生工生物工程(上海) 股份有限公司进行纯化、克隆和测序。 将测序结果拼接后在NCBI 上进行相似性比对。

2 结果

2.1 症状描述

在田间被大量环线虫严重侵染的花生植株，地上部叶片黄化，表现出生长不良状。 地下部的根系不发达，有大片线虫侵染后形成的坏死斑。 在体视显微镜下解剖根系，可以观察到取食根系的环线虫(图1A、B)。 为了更清楚的观察线虫的侵染状态，对病组织进行染色，可以看到入侵的环线虫(图1C)。

图1 装饰中环线虫危害花生的田间症状Figure 1 Symptoms of peanut caused by M. ornata

2.2 病原线虫形态学鉴定

2.2.1 形态测量值 宁德霞浦种群♀(n＝25):L(体长)＝498.5±43.8(401.3 ～576.9)μm；Lv(头端至阴门的距离)＝462.3±41.0(370.2 ～534.8)μm；V.A.(阴门至肛门的距离)＝9.8±2.2(5.4～14.3)μm；St(口针长)＝54.7±2.5(49.9 ～58.7)μm；StC(口针锥体长)＝40.3±1.6(37.0 ～43.2)μm；StB(口针基杆长)＝10.1±1.4(7.0 ～12.2)μm；StKH(口针基球高)＝4.3±0.4(3.6 ～5.0)μm；StKW(口针基球宽)＝8.6±0.5(7.5 ～9.4)μm；DGO(背食道腺开口至口针基部球的距离)＝5.3±0.3(4.8～5.7)μm；EP(排泄孔至头端距离)＝127.3±5.4(120.7 ～133.6)μm；MEL(中食道球长度)＝27.4±3.4(22.4～31.9)μm；MEW(中食道球宽度)＝17.2±1.4(13.8 ～19.5)μm；OV(卵巢长)＝110.1±15.8(92.6 ～132.8)μm；W(最大体宽)＝42.7±4.9(34.2 ～51.4)μm；VBW(阴门处体宽)＝29.4±3.6(23.9～36.0)μm；ABW(肛门处体宽)＝25.8±3.0(20.5 ～30.6)μm；Tail(尾长)＝25.5±2.3(21.2～30.3)μm；R(体环总数)＝87.5±2.5(82.0 ～93.0)；Rst(口针基球至头端的体环数)＝13.7±0.8(12.0～15.0)；Roes(食道基球末端至头端的体环数)＝23.3±1.2(21.0 ～26.0)；Rex(排泄孔至头端的体环数)＝25.3±1.3(23.0 ～27.0)；RV(阴门至虫体末端的体环数)＝6.8±0.6(6.0～8.0)；Ran(肛门至虫体末端体环数)＝5.0±0.5(4.0～6.0)；RVan(阴门至肛门的体环数)＝1.8±0.4(1.0～2.0)；a(体长/最大体宽)＝11.8±1.3(9.1 ～14.3)；b(体长/头端至食道与肠连接处的距离)＝4.3±0.2(4.0～4.7)；c(体长/尾长)＝19.8±1.8(17.4 ～24.0)；c′(尾长/肛门处体宽)＝1.0±0.1(0.8 ～1.2)；V/%(头端至阴门距离/体长×100)＝92.7±0.8(91.3 ～94.2)；St/%(口针长/体长×100)＝11.0±1.0(9.4～13.9)；Lv/VBW(头端至阴门的距离/阴门处体宽)＝15.9±1.8(12.3～19.6)；EP/%(排泄孔至头端距离/体长×100)＝25.6±1.0(24.4～26.6)。

2.2.2 形态特征描述 雌虫:虫体粗大、圆筒形，死后体稍向腹面弯曲或僵直；体环后翻、光滑，体环数为82 ～93 条(图2A)。 口针长、强壮，针锥长约为针杆长的4 倍，基部球前缘突起、呈锚状，自基部球至头端的体环数为12 ～15 条；背食道腺开口到口针基部球的距离为4.8 ～5.7 μm；环型食道，中食道球强大、卵圆形，后食道球较小、梨形，食道腺与肠平截；排泄孔位于食道-肠瓣门后方，约为虫体自上而下的25%位置，至头端的体环数为23 ～27 条(图2B)。 前伸单生殖腺，卵巢长约为93～133 μm(图2C)，受精囊椭圆形，充满精子。 阴门张开，位于虫体自上而下的93%位置，到尾端的体环数为6～8 条；肛门开口小，靠近阴门，与阴门隔1 ～2 个体环的距离；尾钝圆(图2D)。

雄虫:未见。

图2 装饰中环线虫的显微形态特征Figure 2 Morphological characteristics of M. ornata

2.3 病原线虫分子生物学鉴定

2.3.1 ITS 区扩增结果与序列比对 将采自花生上的环线虫的rDNA-ITS 区进行扩增，得到约为1 000 bp 的片段(图3)；经测序，获得长度为1 022 bp 的序列。 同时，将该序列在BLAST 上比对分析，发现与其他环科线虫区别开来，序列同源性最高的是Criconemoides brevistylus，为94%；其次是Hemicriconemoides kanayaensis，序列相似性为83%。 由于同源性较低，无法确定该环线虫的种类。

2.3.2 D2D3 区扩增结果与序列比对 将环线虫的rDNA-D2D3 区进行扩增，得到约为750 bp的片段(图3)；经测序，获得长度为769 bp 的序列。 同时，将该序列在BLAST 上比对分析，发现与Mesocriconema xenoplax的rDNA-D2D3 序列相似性最高，为99%。 由此可以得知，该环线虫与异盘中环线虫(M. xenoplax)同源性最高，可以将该环线虫确定为是中环属线虫。

图3 装饰中环线虫PCR 产物电泳图Figure 3 PCR product amplified from ITS and D2D3 region of M. ornata

2.4 分类地位

综合形态学测量观察数据及分子生物学测定结果，同时与Nyczepiret al(1988)的描述比对，将本研究的花生环线虫鉴定为装饰中环线虫[Mesocriconema ornata(Raski) Luc ＆ Raski]。

3 小结与讨论

在福建省宁德市的花生产区采集到的寄生线虫，会导致花生植株长势衰弱，叶色黄化。 对病根进行组织染色，可见线虫侵染取食根系。 对该病原线虫进行形态特征观察和测量，与装饰中环线虫的原始描述大体一致(Nyczepiret al，1988)。 在测序比对中，与该线虫的rDNA-ITS区序列同源性最高的只有94%；而与rDNA-D2D3 区序列同源性最高的达到99%。 由此可见，环线虫的rDNA-D2D3 区序列更适合作为其种类鉴定的依据之一。 本研究于福建省宁德市分离出该病原线虫，系我国首次较为完整的观察和记述装饰中环线虫侵染花生。 目前，福建省已有多个花生产区发现装饰中环线虫的侵害(章淑玲等，2012；李世通，2013)，需引起有关部门的重视，及时采取相应的措施防控该病害的蔓延。