Wnt/β-catenin拮抗剂DKK-1在强直性脊柱炎中的研究进展

蔡鑫 唐芳 马武开 蒋总 樊梅 金泽旭

【摘 要】 强直性脊柱炎是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，其病理性骨形成的机制尚未明确，目前治疗效果并不理想。Wnt通路抑制剂Dickkopf-1（DKK-1）在强直性脊柱炎疾病过程中发挥重要作用。通过综述DKK-1在强直性脊柱炎成骨中的作用和在血清中表达的意义，以及中医药干预强直性脊柱炎取得的研究成果，以期为进一步研究探索强直性脊柱炎病理性骨形成的分子机制和靶向治疗提供新的思路。

【关键词】 脊柱炎，强直性;Wnt信号通路;DKK-1;骨代谢;中医药;综述

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种免疫介导的炎症性疾病，在全球范围内的发病率约为0.2%～1.4%[1]。AS主要病理改变为关节炎症和新骨形成，最终导致脊柱僵硬和丧失活动能力，严重降低了患者的生活质量[2]。AS的发病机制尚不清楚，遗传和环境因素的相互作用可能是其中的原因之一。虽然当前AS的治疗已经取得了很大的进展，但是效果仍不理想[3]。经典Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路的激活在AS病理性骨形成中发挥关键作用，最新研究表明，Dickkopf-1（DKK-1）蛋白与AS发病过程关系密切[4]。

1 Wnt通路和DKK-1生物学特性

Wnt家族由许多小的、富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白组成，参与调控各种细胞活动，在发育过程中起着至关重要的作用[5]。Wnt蛋白通过包括β-catenin在内的多个蛋白复合物触发细胞内的信号通路。在没有Wnt蛋白的情况下，β-catenin保持在较低水平，游离的β-catenin被26S蛋白酶体泛素化和降解。含有激酶GSK-3β和酪蛋白激酶-1（CK-1）的蛋白复合物，连同架构蛋白轴抑制蛋白1（Axin1）、腺瘤性息肉病蛋白（APC）及散乱蛋白介导了β-catenin的降解[6]。这种复合物磷酸化β-catenin上的特定氨基酸残基，为F-盒蛋白/E3连接酶复合物创造对接位点。因此，抑制β-catenin磷酸化可防止其降解，增加细胞质水平并促进核易位，与TCF/LEF转录因子相互作用，激活靶基因的表达[7]。DKK-1最初作为一种诱导头部发育的分泌性蛋白在1998年被报道，是Wnt信号通路的有效抑制剂[8]。随后的研究报道了在骨髓瘤细胞中DKK-1表达的增加与骨侵蚀呈正相关，意味着DKK-1可能抑制成骨细胞的分化或功能[9]。在杂合子DKK-1缺陷小鼠中，可通过显著提升成骨细胞活性而导致骨形成和骨量增多[10]。

2 DKK-1在AS中的作用

AS是一种慢性炎症性疾病，新骨形成是AS的重要特征，而过度的新骨形成可能导致关节或脊柱强直。进一步的证据表明，DKK-1不仅与周围关节骨重塑相关，还参与AS典型病理过程中的骶髂关节侵蚀和融合，功能性DKK-1是AS病情进展的潜在生物标志物，阻断DKK-1的表达可促进脊柱关节融合，但对于AS患者血清DKK-1表达水平的研究结果并不一致[11-12]。

2.1 DKK-1通過微小核糖核酸（miRNAs）影响AS骨形成 miRNAs是一组长度约为22个核苷酸的非编码小RNAs，通过与靶mRNAs的3'-非翻译区（3'-UTR）结合在转录后水平调节基因表达，已被证实参与调控细胞增殖、分化、凋亡和免疫应答等多种生物学过程[13]。AS病理性新骨形成的机制尚未明确，但有证据表明，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1在此过程中发挥重要作用[14]。有研究指出，AS患者功能性DKK-1（与LRP-6结合）水平低于正常人，且DKK-1与AS的影像学严重程度呈负相关[15]，而功能性DKK-1的高表达可抑制AS的新骨形成、骨赘生长和脊柱强直[16]，阻断DKK-1则能够促进骨形成和骶髂关节及轴向关节强直[17]。

miR-146a位于5q33.3染色体上，是免疫系统疾病的重要调控因子[18]，miR-146a的单核苷酸多态性（SNP）与AS相关，并且在AS患者血清中高表达，可作为其生物学标志物[19-20]。成纤维细胞来源于间充质干细胞，是关节周围结缔组织中常见的细胞类型，在一定条件下具有成骨分化潜能[21]。AS患者髋关节囊组织中miR-146a表达上调，DKK-1 mRNA表达下调，miR-146a与DKK-1 mRNA水平呈负相关。研究人员使用AS成纤维细胞作为模型用于评估miR-146a在AS发展中的作用和分子机制，发现miR-146a抑制剂转染AS成纤维细胞后，可显著抑制AS成纤维细胞的增殖和成骨分化潜能，同时能诱导AS成纤维细胞凋亡，而miR-146a过表达则发挥相反的作用，鉴于miR-146a与DKK-1之间的负相关性，进一步研究发现miR-146a通过直接靶向作用于DKK-1的3-UTR，从而抑制DKK-1的表达[22]。成骨标志物（Runx2、ALP）在miR146a缺陷的AS成纤维细胞中的表达明显下调，在miR-146a增强的细胞中显著上调[23]。表明miR-146a缺陷或过表达，能通过调控DKK-1的表达从而影响AS成纤维细胞的增殖、凋亡和成骨分化潜能。

miR-29a主要通过经典Wnt信号通路正向调控成骨分化，能够防止糖皮质激素引起的大鼠骨质疏松和脆性骨折，并且在AS患者中表达具有显著差异性[24-25]。

与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和正常对照组相比，AS患者miR-29a的表达特异性显著升高[26]。miR-29a在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的抗骨质形成过程中明显减少，阻断TNF-α可以上调其表达。作为经典Wnt/β-catenin信号传导负调节剂的DKK-1和GSK-3β参与炎症介导的骨破坏，Kremen2、DKK-1及sFRP2是与骨形成相关的miR-29a的直接靶基因，LI等[25]在此基础上将GSK-3β鉴定为miR-29a的新靶标蛋白，抗miR-29a在蛋白质水平上增加DKK-1和GSK-3β的表达。TNF-α抑制核β-catenin的表达，这种现象可以通过增强miR-29a的表达或降低DKK-1、GSK-3β的水平来缓解，同时提高TCF/LEF的转录活性。这表明miR-29a通过靶向作用于Wnt信号通路抑制剂DKK-1和负调控蛋白GSK-3β，可能在AS病理性骨形成中发挥重要作用。

综上所述，Wnt信号的减弱抑制了AS新骨形成，从而抑制了骨赘生长和脊柱强直。miRNAs通过靶向作用于Wnt通路拮抗剂DKK-1或GSK-3β，从而增强信号传导活性，对于探索DKK-1在AS病理生理过程中的分子机制和研究更有效的AS治疗靶点具有重要意义。但是，由于miRNA可能调节下游信号中多种靶向蛋白质，因此在未来的研究中应尝试探索其他靶标蛋白的参与。

2.2 DKK-1在AS患者血清中的表达 研究发现，DKK-1与AS病理改变有关，但是关于血清DKK-1水平与AS之间关系的研究结果并不一

致[27-28]。这可能与AS患者韧带骨赘形成有关，伴有韧带骨赘形成时DKK-1水平较低，反之则表达上调。例如一些研究报道了AS患者存在DKK-1功能失调并且血清中表达较高水平的DKK-1[29-31];然而有学者报告了相反的结果，与健康人相比，DKK-1水平在AS患者血清中明显降低[32-33]。还有研究报道AS患者血清DKK-1水平与健康对照组差异无统计学意义（P > 0.05）[34-35]。

HUANG等[30]使用ELISA法检测Wnt信号通路DKK-1、GSK-3β、β-catenin在AS患者和健康对照组血清中的表达，结果显示，GSK-3β、β-catenin在2组中的表达并没有明显差异，而AS患者血清DKK-1水平则显著高于对照组，提示DKK-1可能特异性过表达于AS病理过程。ROSSINI等[32]研究发现，与健康人相比，AS患者血清DKK-1表达显著降低，AS患者血清DKK-1水平与脊柱骨密度Z值呈负相关，血清DKK-1水平越高，椎体骨折的发生率亦越高。DKK-1可能与AS发生骨质疏松的严重程度有关，表明血液循环中DKK-1水平降低促进了Wnt信号过表达，在AS病理性骨形成中发挥了关键作用。SAKELLARIOU等[34]研究表明，DKK-1在AS患者与健康人之间表达差异无统计学意义（P > 0.05）;但随着AS患者红细胞沉降率（ESR）和C-反应蛋白（CRP）的增加，DKK-1水平随之上调，提示DKK-1不仅与AS病理成骨有关，还与影响全身骨重建的炎症相关，临床将血清DKK-1水平用于评估AS患者系统性骨质流失或者韧带骨赘形成的危险因素具有一定帮助。CRP是应用最广泛的全身炎症生物标志物，改良Stoke强直性脊柱炎脊柱评分（mSASSS）是评价AS影像学进展的推荐指标，能较好反映AS患者脊柱关节的侵蚀、硬化和融合程度[36-37]。WU等[12]对23项研究进行了荟萃分析，证实在AS患者和健康人之间血清DKK-1浓度并没有明显差异，但是通过亚组分析表明，CRP和mSASSS越高的患者血清DKK-1水平更低。提示血清DKK-1在AS患者与健康人之间的表达虽然不具有差异性，但是可用于反映炎症程度和影像学损害进展，有潜力作为预测骶髂关节炎放射学进展和脊柱关节韧带骨赘形成的良好指标。DKK-1在AS疾病进展中的潜在机制则需要进一步深入研究。

3 中医药上调AS患者DKK-1的表达

部分学者使用中医药治疗AS取得了较好效果，其机制可能是通过上调血清DKK-1的水平而抑制Wnt信号通路，最终起到缓解AS疾病进展的作用。

孔维萍等[38]在一项前瞻性病例研究中纳入45例肾虚督寒型AS患者，经补肾强督方治疗6个月后，采用ELISA检测发现血清DKK-1水平较治疗前明显升高，同时显著降低AS患者ESR、CRP等炎性指标及枕墙距、指地距等病情评价指标，且治疗过程中未出现严重不良反应。苏小军等[39]观察45例肝肾亏虚型AS患者，发现使用五劳七损方治疗能显著提高AS患者DKK-1水平，表明该方可能通过发挥补肝肾、温督脉的作用而上调DKK-1，进而影響AS病理性成骨过程。游济洲等[40]使用三四祛痹汤联合柳氮磺吡啶治疗湿热痹阻型AS患者90例，结果有效降低了促炎因子白细胞介素（IL）-4、IL-18的表达，显著升高DKK-1水平，改善AS患者疾病活动度，总有效率及各项指标的改善均优于单独使用柳氮磺吡啶的对照组，提示联合该方治疗能够较好促进AS患者关节活动功能的恢复。

4 小 结

总之，目前AS发病过程中病理性骨形成的机制尚不明确，临床疗效有限。经典Wnt信号通路作为调控骨代谢的关键信号通路之一，其抑制剂DKK-1在AS的新骨形成中发挥关键作用，也与其疾病活动及影像学进展有关，有潜力作为监测疾病进展的生物学标志物。当前，对于DKK-1在AS中的研究已经取得了一定进展，在此基础上进行更加深入的研究，或许会对AS发病分子机制的理解有重要突破。虽然关于AS患者血清DKK-1水平的研究报道并不一致，但从另一方面提示了DKK-1在其发病过程中的重要意义。应用中医药辨证论治AS能取得较好的临床疗效，与上调DKK-1的表达相关，但其具体的分子机制尚需进一步探索。相信随着分子生物信息技术及研究的逐步推进，对于AS发病机制的理解以及靶向治疗药物的研发将会步入新的阶段。

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收稿日期：2019-07-26;修回日期：2019-09-18