Ganoderma sp. X1固态发酵改善酒糟品质

裴久文， 方 勇， 高学志， 谢国排， 房 伟， 方泽民

(1. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601； 2. 现代生物制造安徽省重点实验室， 合肥 230601；3. 安徽省微生物与生物催化工程研究中心， 合肥 230601； 4. 阜阳市畜禽养殖服务中心， 阜阳 236012)

饲料是养殖业的基础支撑，也是动物性食品安全的源头。虽然我国饲料市场发展前景广阔，但是蛋白饲料资源依然短缺，自给自足率不足50%，每年需从国外进口大量豆粕、鱼粉等以填补国内市场的不足[1]。为了解决我国蛋白质饲料资源不足的问题，除了要充分开发利用常规蛋白饲料资源，还要充分挖掘我国大量的非常规饲料资源，如酒糟、醋糟、酱渣、秸秆、工业废弃物等[2]。而采用现代生物技术开发利用非常规饲料资源，能够使其中的抗营养因子钝化或脱毒，同时提高可利用营养物质的含量，提升饲料的适口性和消化率[2]。

白酒糟渣是一类重要的非常规饲料资源，占全国年生产各类糟渣的70%以上。根据国家统计局公布数据，2017年我国白酒产量约为1198万t，酒糟的年产约为3594万t。由于白酒糟酸度高、水分高，量大而集中，如不及时加以处理，极易腐败变质，造成环境污染。目前，国内白酒产业对白酒糟最为普遍的处理方式是作为饲料行业的原料或基质，一般经干燥脱水甚至直接打包出售，附加值较低。

近年来，将白酒糟作为发酵基质，通过微生物发酵生产蛋白饲料是酒糟饲料化的研究热点，也是实现糟渣再利用的经济可行的方法之一[3]。然而，在现有工艺中，酒糟木质素未能得到有效降解。白酒糟中的木质素约占13%～18%，主要来自于发酵过程中添加的稻谷壳(约占干酒糟的40%～50%)[4-5]。由于木质素不能被瘤胃微生物所分解，限制了反刍动物对酒糟类饲料的高效利用。因此，木质素使酒糟饲料的消化率及饲用价值降低，成为饲料中的抗营养因子。在酒糟高蛋白饲料生产中，添加木质素降解菌，降解其中的抗营养因子——木质素，使与木质素交联的细胞壁多糖游离出来，同时释放细胞壁内可利用营养物质，是提高酒糟饲料利用效率的有效途径。

自然界中，白腐真菌(White-rot fungi)是已知的能够有效降解木质素的一类真菌，能通过分泌木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)等木质素降解酶，在分子氧的参与下，依靠自身形成的H2O2，触发一系列自由基反应，实现对木质素无特异性的氧化分解[6-8]。已有研究报道，白腐真菌应用于生物降解秸秆木质素以协同发酵生产饲料，包括Pleurotusostreatus[9-10]，Lentinulaedodes[11-12]，Phanerochaetechrysosporium[13]等。以白酒糟为基质，目前仅有白腐真菌Phanerochaetechrysosporium被用以降解白酒糟木质素[4]。Ganodermasp.真菌是自然界木质素的有效分解者，可表达多种木质素降解相关酶[14]，在木质素降解方面具有重要的应用价值。本研究采用Ganodermasp. X1固态发酵白酒糟，优化降解条件，以高效降解酒糟中的木质素，提高粗蛋白的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

Ganodermasp. X1为本实验室从枯木中分离筛选到的一株漆酶高产菌株。白酒糟由安徽金种子酒业股份有限公司提供，主要成分为高粱、稻壳。

YMG培养基(1 L)：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1Ganodermasp. X1生长最适pH值

配制YMG平板，灭菌前配制含200 mL YMG的培养液的500 mL三角瓶，调节液态YMG的pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待温度适中，倒平板。在同一个培养平板上取1 cm2左右的菌块，接种至不同pH值平板上，每个pH值梯度3个重复，28 ℃恒温培养箱培养6 d，每天记录菌丝生长直径。

1.2.2 固态发酵培养基制备

从工厂取得新鲜酒糟，85 ℃恒温烘干至恒重，称取(10±0.05)g干酒糟至100 mL三角瓶中，按照固态发酵正交试验设计，用pH 6.5磷酸盐缓冲液调节培养基pH值及含水量，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却后备用。

1.2.3Ganodermasp. X1酒糟固态发酵

明确Ganodermasp. X1最适生长pH值后，采用L9(33)正交试验(表1)进行固态发酵，一共9组，每组3个重复。按照实验设计进行接种，恒温箱静置培养。

表1 固态发酵正交试验设计

1.2.4 发酵后成分检测

酒糟固态发酵后，发酵产物烘干称重，检测粗蛋白、纤维素、木质素的含量，参照参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[15]。

1.2.5 发酵产物选择性指数分析

发酵后，以木质素和纤维素失重的比值(选择性指数，SF)作为依据，进行木质素降解最适条件的分析[16]，SF值越大，表明降解木质素保留纤维素效果越好。

采用Excel对数据进行处理，SPSS17.0对数据进行分析并结合Duncan法进行多重比较显著性差异分析。

1.2.6 麸皮添加对酒糟发酵的影响

发酵培养基的干重为10 g，其中酒糟与麸皮的比例分别为8∶2～3∶7，加入烘干的100 mL三角瓶中进行固态发酵，发酵条件为培养基含水量75%，温度28 ℃，接种量10%，发酵产物的检测方法同1.2.4和1.2.5。

1.2.7 饲料感官性质分析

根据《青贮饲料质量评定标准》评判饲料感官性质[17]，包括发酵产物的气味、手感、颜色和有无变质等感官指标，劣等品质，腐烂的气味，色泽是黑褐色，质地粘结成块；一般品质，刺鼻酒酸味，暗褐色，质地略带黏性；良好品质，淡酸味，褐黄色，质地不粘手；优等品质，甘酸香味，闻着舒适，亮黄色，质地松散软弱，不粘手。

2 结果与分析

2.1 Ganoderma sp. X1最适生长pH值

从生长趋势可知，培养基pH 6时，Ganodermasp. X1生长速度最快(图1)。许多白腐真菌偏好在pH 4.0～5.0的微酸性的环境下生长[18]，但也存在pH 7.0～9.0生长的白腐真菌[19]。因此，不同菌种适宜的生长环境不尽相同。固体培养基在灭菌的过程中pH会降低0.5～1.0，因此选择pH 6.5的缓冲液调节固态发酵培养基pH值。

图1 Ganoderma sp. X1生长最适pH值

2.2 固态发酵产物成分测定

测定固态发酵产物基本成分含量可知，木质素含量随着发酵时间的延长而减少，表明Ganodermasp. X1可以有效降解木质素，其中第7组木质素降解率最高，达到47.10%(图2-a)。纤维素的含量随着发酵时间的延长而减少(图2-b)，表明Ganodermasp. X1可以有效降解纤维素，其中第4组纤维素降解最高，达到29.81%，而第7组纤维素降解最低，达到13.55%，说明第7组发酵条件能够很好地保存纤维素，减少营养成分的损失。粗蛋白的含量随着发酵时间的延长而增加(图2-c)，其中第7组发酵15天的增加量最高，达到1.34 g，粗蛋白含量增加至17.30%。

2.3 选择性指数分析

酒糟的微生物固态发酵一方面要求高效降解木质素，另一方面要求能够尽可能保存其中纤维素，即选择性指数(SF)高[16]。因此，对发酵15 d的酒糟产物的SF值进行了分析。结果表明，不同发酵条件下木质素降解和纤维素的消耗存在很大差异。由表3可知，第7组发酵条件获得的发酵产物的SF值最高，是较优的发酵条件。通过单因素不同水平的比较，可知采用含水量75%的固态培养基质，以10%接种量，28 ℃培养15 d，木质素降解率均最高。

a木质素Lignin;b纤维素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

图2固态发酵后不同时间的产物成分含量
Figure 2 The fermented products in distiller grains after fermentation different time

表3 SF的测定结果

注：SF是木质素/纤维素的比值，SF值越大，表明降解木质素保留纤维素效果越好

2.4 显著性分析

对木质素的降解率的影响因素进行极差法分析(表4)。在接种量、含水量和温度单因素影响下，SF值的极差值R分别为0.71、0.56和0.99，即三因素对木质素降解的影响程度为温度>接种量>含水量。然而，接种量、含水量和温度对SF值影响差异不显著(P>0.05)。通过单因素不同水平比较，10%接种量、75%含水量、28 ℃为较好的发酵条件，得出第7组是最优的发酵条件。

2.5 固态发酵培养基酒糟与麸皮配比优化

2.5.1 发酵产物木质素、纤维素及粗蛋白含量测定

采用酒糟与麸皮5∶5配比的固态培养基质，发酵10 d，木质素的降解率最高，达到46.36%(图3-a)，纤维素的降解率最大，达到50.52%(图3-b)。随着发酵时间的延长，粗蛋白含量呈增加的趋势(图3-c)。采用酒糟与麸皮5∶5比例的固态培养基质，粗蛋白含量增加最快，发酵10 d达到最高，从初始的1.39 g增加到1.64 g，粗蛋白含量增加至24.80%，较仅以酒糟为培养基质的发酵产物的粗蛋白含量(17.30%)有较大提升。因此，以酒糟与麸皮为培养基质进行固态发酵，能够有效的提高粗蛋白的含量，同时缩短发酵时间。

表4 选择性指数显著性分析

注：同一列据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.5.2 不同培养基配比发酵产物SF值分析

固态发酵10 d后，由表5中SF值可以看出酒糟和麸皮3∶7的SF值最高，其次是5∶5的比例。说明Ganodermasp. X1在这两个比例中有较好的木质素降解能力。但5∶5的比例木质素有最高降解率，而且粗蛋白的含量增加最高，因此选择酒糟与麸皮5∶5的配比作为最适的发酵培养基。

a木质素Lignin;b纤维素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

图3酒糟与麸皮配比优化后的发酵产物成分含量

Figure 3 The fermented producs in the distiller grains after optinization of the ratio of distiller grains and to wheat bran

表5 SF的测定结果

1、4：发酵前；2、5：发酵5 d；3、6：发酵10 d

图4发酵前后酒糟的形态

Figure 4 Changes in the state of the distillers grains

2.6 发酵前后酒糟感官评价

发酵前后固态培养基形态参考《青贮饲料质量评定标准》评价，原始状态的干酒糟有刺鼻酒酸味，色泽为黑褐色，质地粘结成块，为一般品质(图4)。当发酵至第5天时，培养基中菌丝大量生长，淡酸味、褐黄色、略带黏性，为较好品质；发酵至第10天时，菌丝聚集形成厚厚的菌质体，打开纱布，会闻到淡淡的清香味，酒糟呈亮黄色，质地松软，为良好品质。这说明当酒糟与麸皮的比例适当，会加快菌丝的生长，同时会产生菌质体，改善酒糟的品质。

3 讨论与结论

灵芝是一类重要的白腐真菌，其对木质素的利用强于对纤维素和半纤维素的利用。灵芝可胞外分泌多种木质素分解酶，包括LiP、MnP和laccase，将木质素等分解为小分子的单糖或双糖[20]。另一方面，灵芝能够分泌淀粉酶、蛋白酶、以及纤维素分解酶等其他酶系，这些酶可能在灵芝降解木质素过程中直接或间接地发挥作用[21]。以灵芝为发酵菌株，固态发酵玉米秸秆、稻草等农业废弃物，降解其中木质素，是此类资源利用的有效途径。孙芹英等[22]用灵芝固态发酵产漆酶及对秸秆木质素的降解中，在发酵30 d时,玉米秸秆的木质素降解率最大，达到23.7%，油菜秸秆也达到了16.2%。Shrivastava等[23]用灵芝固态发酵秸秆制备反刍动物饲料，在发酵15 d后，酸性洗涤纤维素含量、中性洗涤纤维素含量和半纤维素的含量分别降至24.77%，31.03%和42.51%，且秸秆木质素含量降低34.95%。

本研究中，采用具有Ganodermasp. X1固态发酵白酒糟，降解酒糟中的木质素，发酵15 d木质素的降解率可达47.10%，且粗蛋白达到17.30%。由此推测，Ganodermasp. X1可能分泌木质素降解相关酶，部分分解酒糟中的木质素，其降解周期及效率高于黄孢原毛平革菌对白酒糟木质素的降解[24]。另一方面，灵芝菌体生物活性成分多样，含有多糖类、萜类、生物碱类、氨基酸蛋白质类等多种成分[25]。因此Ganodermasp. X1发酵白酒糟后能够有效提升发酵产物粗蛋白含量，并且菌种在代谢过程中可能产生多种活性成分,丰富发酵饲料的营养。

麸皮是一类重要的农副产品，其可有效地诱导白腐真菌中相关木质素降解酶的产生[25]。将麸皮与酒糟配比后作为固态发酵基质，发酵10 d，木质素降解率可达46.36%，且粗蛋白含量提升至24.80%。因此采用麸皮白酒糟混合基质发酵，能够更有效地促进Ganodermasp. X1对木质素的降解，并提升粗蛋白含量，同时缩短了发酵时间。

以上研究表明Ganodermasp. X1固态发酵白酒糟能有效地提高酒糟的品质，一方面有效降解酒糟中木质素并保存纤维素；另一方面可有效提高粗蛋白的含量，有效保存营养，因此在降解酒糟木质素制备高品质粗饲料方面具有潜在的应用价值。