高效液相色谱法测定红香酥梨中6 种有机酸含量

李彩林，杨志国，王华瑞，李美萍

（1.山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，山西太原030031；2.山西大学生命科学学院，山西太原030006）

红香酥梨是由中国农业科学院郑州果树研究所以库尔勒香梨与鹅梨杂交选育而成的新梨品种，其果皮薄、汁多、肉脆、香甜可口，且丰产耐贮，因此，具有良好的发展前景[1-2]。果实中有机酸含量及种类是决定果实内在品质的重要因素之一[3-4]，也是水果中主要的营养物质之一，它不仅对水果的口感、色泽及生物稳定性有影响，而且可以促进人们的食欲[5]，因此，研究红香酥梨中有机酸种类及含量对红香酥梨的开发和利用具有重要意义。

有机酸的测定方法有氢氧化钠滴定法[6]、离子色谱法[7]、气相色谱法[8]和高效液相色谱法[9]等。由于高效液相色谱法具有灵敏度高、准确度好、操作简便等优点[10-11]，因此，其被广泛应用于枣[12]、苹果[13]、蓝莓[14]、杨梅[15]等水果中有机酸的检测。孙延芳等[16]利用高效液相色谱法对酸枣中的有机酸和维生素C 含量进行了检测；关秀杰等[17]利用反相高效液相色谱法对火龙果中的6 种有机酸含量进行了测定；胡志群等[18]测定了妃子笑和糯米滋2 个荔枝品种中有机酸、可溶性糖和维生素C 的含量变化；王琴飞等[19]建立了西番莲中有机酸含量的高效液相色谱检测方法；RODRIGO 等[20]对水果果汁中苹果酸、酒石酸和Vc 进行了检测；马倩倩等[21]对南疆地区骏枣和0604 酸枣果实中主要有机酸和Vc 进行了定量分析。但目前关于红香酥梨中有机酸含量测定尚未见文献报道。

本试验旨在建立一种高效、快捷测定红香酥梨中有机酸含量的方法，以期为红香酥梨的品质研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 试验所用红香酥梨采于山西省运城市盐湖区百忍堂农场，采后立即运回山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所冷库中（（-1.0±0.5）℃），挑选无病虫害、无腐烂、无机械损伤的红香酥梨作为试验材料。

1.1.2 仪器设备与试剂 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）配有四元泵、真空脱气机、手动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站；CAPECELL PAK MG S5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Milli-Q Academic 超纯水机（美国密理博公司）；AS10200AH 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Allegra X-30R Centrifuge 高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；SHA-C 水浴恒温振荡器（金坛市金城国胜实验仪器厂）；研钵；IMS-20 全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；Sartorius CP224S 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；0.45 μm 微孔滤膜。

供试试剂为D- 苹果酸、L- 苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸标准品（Sigma 公司）；甲醇（色谱纯）；磷酸（分析纯）、高纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 CAPECELLPAKMGS5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液- 甲醇，其体积比为96∶4，等度洗脱；柱温40 ℃，流速1 mL/min；检测波长为210 nm；进样量20 μL。

1.2.2 有机酸标准品母液配制 分别精密称取D-苹果酸、L- 苹果酸、柠檬酸、乳酸各0.25 g 以及酒石酸0.125 g、琥珀酸0.625 g 于50 mL 烧杯中，加超纯水溶解后转移至50 mL 容量瓶中定容，制成D-苹果酸、L- 苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的标准贮备母液。

1.2.3 混合标准溶液的配制 将1.2.2 配制好的标准贮备母液用0.1%磷酸水溶液依次稀释成2.5，1.0，0.5，0.25，0.2，0.1，0.05，0.025，0.02，0.01，0.005 mg/mL的系列混标溶液，将系列混标溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤（与样品的色谱条件相同）后注入高效液相色谱仪中进行标准曲线的绘制。

1.2.4 样品的处理 称取20 g 新鲜果肉，加入5 mL 0.1%的磷酸水溶液冰浴研磨成匀浆后转入100 mL三角瓶中，用0.1%的磷酸水溶液多次冲洗研钵后将三角瓶置于35 ℃的混合振荡器中振荡30 min，再将其转入50 mL 离心管中超声波提取30 min，使有机酸充分浸出，冷却后在4 ℃下以9 000 r/min 离心20 min，上清液过滤到50 mL 容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容至刻度，待测液用0.45 μm 滤膜过滤后注入高效液相色谱仪中进行分析。

1.3 数据处理

采用Excel 软件对数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照1.2.1 的色谱条件将不同浓度的系列混标溶液依次进样，每个浓度重复3 次取其平均值，以峰面积（Y）对质量浓度（X，mg/mL）求标准曲线的回归方程和相关系数，结果列于表1。

表1 6 种有机酸对照品标准曲线方程

从表1 可以看出，6 种有机酸的相关系数均达到0.999 9，表明线性关系良好，说明可以用此标准曲线来测定红香酥梨中有机酸的含量。

2.2 有机酸标准品与红香酥梨样品高效液相色谱分析

取D- 苹果酸、L- 苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸的混标溶液进样，其色谱图如图1 所示。取红香酥梨样品提取液进样，其色谱图如图2 所示。

从图1 可以看出，6 种有机酸标准品在此色谱条件下均得到良好的分离，且峰形良好，各组分的出峰顺序依次为酒石酸、L- 苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、D- 苹果酸，其出峰时间分别为3.185，3.893，4.679，6.865，7.483，8.989 min。

由图2 可知，红香酥梨中含有D- 苹果酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸6 种有机酸，且各有机酸的分离度较好，其出峰时间分别是3.186，3.947，4.894，6.985，7.657，9.022 min。由此可以看出，待测样品的出峰时间较标准品稍晚一些。

2.3 精密度检测

按照1.2.1 的色谱条件将0.2 mg/mL 的混合标准溶液连续进样5 次，考察该方法的精密度，根据峰面积计算酒石酸、L- 苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、D- 苹果酸的相对标准偏差（RSD），其结果分别为1.31%，1.54%，2.64%，1.32%，0.77%，0.32%，表明该方法的精密度良好（表2）。

表2 精密度试验结果（n＝5）

2.4 重复性检测

按1.2.4 的方法制备同一份红香酥梨样品5 份，在1.2.1 的色谱条件下进行样品分析，根据得到的峰面积计算各有机酸的重复性，得出D- 苹果酸、L- 苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的相对标准偏差（RSD）在0.66%～3.07% ，说明该方法的重复性达到分析的要求（表3）。

表3 重复性试验结果（n＝5）

2.5 稳定性检测

表4 稳定性试样结果（n＝6）

取同一份红香酥梨样品贮备液，按照1.2.1 的色谱条件进行测定，分别记录样品在贮藏0，2，4，6，8，12 h 下各有机酸的峰面积，从而判断其稳定性。结果显示，酒石酸、L- 苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、D- 苹果酸的相对标准偏差（RSD） 分别为1.44%，1.56%，3.21%，0.92%，3.93%，4.33%，说明供试样品在12 h 内是稳定的（表4）。

2.6 回收率测定

表5 6 种有机酸的回收率（n＝6）

取6 份体积相同且已知各有机酸含量的红香酥梨样品提取液，分别加入相同体积不同质量浓度的有机酸对照品溶液，混合均匀后用0.45 μm 滤膜过滤，在1.2.1 的色谱条件下进行样品回收率试验，结果如表5 所示。结果显示，各有机酸的回收率为96.00%～105.42%，相对标准偏差（RSD）为0.81%～4.68%，表明该方法准确度较高。

2.7 红香酥梨样品中有机酸含量的测定

按1.2.4 方法对红香酥梨样品进行处理，在1.2.1 的色谱条件下，测定红香酥梨中各有机酸种类与含量，每个样品重复3 次，取平均值（表6）。

表6 红香酥梨中有机酸含量测定结果

由表6 可知，红香酥梨中以苹果酸与柠檬酸为主要有机酸，且苹果酸含量最多，为1 493.32 mg/kg，占到有机酸总量的71.16%；其次为柠檬酸（304.78 mg/kg），占到有机酸总量的14.52%；红香酥梨中次要有机酸为琥珀酸与酒石酸，其含量分别为129.35，97.85 mg/kg，分别占到总有机酸含量的6.16%和4.66%；乳酸的含量则相对较低。

3 结论

本研究在CAPECELL PAK MG S5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%磷酸水溶液和甲醇作流动相，柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长210 nm，进样量20 μL 的色谱条件下能有效分离出红香酥梨中6 种有机酸，并对其含量进行了测定，其标准曲线相关系数均在0.999 9 以上，回收率为96.00%～105.42%，精密度、重复性、稳定性的相对标准偏差（RSD）均在5%以内，表明该测定方法良好，且红香酥梨中以苹果酸与柠檬酸为主要有机酸，琥珀酸与酒石酸为次要有机酸，利用该方法对红香酥梨中有机酸积累动态及风味特征的研究具有重要意义。