马铃薯PGA1 基因的克隆及序列分析

闫建俊，白云凤，左静静，裴成成，左 敏

（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）为茄科植物，是世界四大重要粮食作物之一，其具有种植范围广、产量高、适应性强、营养物质丰富且易消化吸收等特点。2015 年，随着马铃薯主粮化战略的启动，马铃薯的生产与加工在人们的日常生活和国民经济中具有举足轻重的作用。但马铃薯块茎中普遍存在一类具有涩味、带毒性的糖苷生物碱，其已被公认为是人类食物中最严重的有毒物质之一[1]。块茎中的生物碱主要是由光照、低温以及机械损伤等产生[2]，当块茎中糖苷生物碱含量超过一定的阈值时，马铃薯的食味性和食用安全性便会受到严重影响，其食用、饲用及加工品质也随之降低[3]。

糖苷生物碱又常被称为甾体糖苷生物碱（Steroidal Glycoalkaloids，SGAs），其是广泛存在于植物中的一类重要的次生代谢物，主要存在于茄科和百合科植物中[4-5]，例如存在于经济价值较高的番茄和马铃薯中[6]。目前，已发现的糖苷生物碱种类超过100 种，平均每年仍有2～3 种新的种类被鉴定发现，马铃薯中被鉴定的生物碱种类也超过了80 多种[6-8]。在马铃薯中，α- 茄碱和α- 查茄碱是栽培种中的2 种主要存在形式，其占到糖苷生物碱总量的95%[9]。在某些野生种和栽培种品种中，还存在一些其他形式的糖苷生物碱，如茄解啶、垂茄啶、番茄啶和莱普亭啶等[10]。马铃薯的芽、皮和芽眼周围分布着较多的糖苷生物碱，主要对呼吸系统和运动系统中枢神经具有毒性，并对生物黏膜具有溶解和破坏作用，严重时可能会致畸甚至致死[11]。通常，马铃薯块茎中糖苷生物碱符合健康标准的含量为0.01～0.10 mg/g，最高不能超过0.20 mg/g[10]。关于糖苷生物碱毒性的研究已引起国内外研究人员的高度重视，尤其成为从事食品安全和医疗保健人员的研究热点。

本研究利用RT-PCR 技术对马铃薯糖苷生物碱合成途径的关键酶基因PGA1 进行了克隆，并利用生物信息学软件分析PGA1 基因的结构，而且预测了PGA1 基因编码蛋白的物理性质及功能等，以期为深入研究分析PGA1 基因的功能提供理论基础，为进一步利用基因工程技术，通过RNAi 技术或基因编辑技术调控生物碱的合成寻求新途径。

1 材料和方法

1.1 材料及主要试剂

供试马铃薯品种为大西洋，由山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因实验室保存。

RNA 提取所用的Trizol 为Invitrogen 公司生产；RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司；PCR 产物胶回收试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector 克隆载体购于北京全式金公司；由北京华大基因公司完成引物的合成及测序工作；其他试剂购自国内外各厂家，均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯总RNA 的提取及cDNA 的合成 采用山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因实验室改进的方法[12]提取马铃薯总RNA，以马铃薯品种大西洋无菌苗叶片为材料，通过液氮速冻、研磨后加入Trizol 试剂，按照说明书提取总RNA。提取完成后，采用非变性的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA 质量。以提取的总RNA 为模板，按照TaKaRa 公司RT-PCR 试剂盒说明转录合成cDNA 的第1 链。

1.2.2 马铃薯PGA1 基因的克隆 根据PGA1 基因已报道的序列（序列号为AB839752.1），利用Primer Premier 5.0 软件设计RT-PCR 引物：正向引物为5′-ATGGCAATTGCAACAGTAATTG-3′，反向引物为5′-TCAAAGCTTGTTGAGGATTATC-3′。以合成的cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增体系为ddH2O33.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正向引物和反向引物各2.5 μL，EX Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，反转录产物cDNA 5 μL，总体积50 μL；扩增程序为95 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。通过1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增得到的产物进行检测，回收目的条带纯化后连接到pEASY 克隆载体上，经过转化、涂平板，挑取单克隆并于加有AMP＋的LB 液体培养基中进行摇菌，通过PCR 扩增菌液，选取呈阳性的菌液送至北京华大基因公司进行测序。

1.2.3 马铃薯PGA1 基因序列分析 将克隆得到的序列通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线网站和MEGA 7.0 软件进行Blast 比对分析，采用邻接法构建系统进化树。用Generunner 软件翻译得到PGA1 基因的氨基酸序列，用ProtParam 对推导获得的氨基酸的组成、理论分子量及等电点进行在线分析[13]，通过PSORT（http：//psort1.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位分析。PGA1 蛋白的跨膜结构通过TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线分析，用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale）软件预测蛋白亲/疏水性，使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）在线分析PGA1 基因编码多肽链的二级结构[14]，蛋白质的三级结构通过在线软件SWISSMODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）分析[15]，采用SignalP 4.0 软件系统分析蛋白的信号肽序列[16]，其他相关在线网站及软件的使用参照文献[17]。

2 结果与分析

2.1 马铃薯PGA1 基因的克隆及序列特征分析

利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的马铃薯总RNA，电泳结果显示（图1），28SrRNA、18S rRNA条带清晰，RNA 完整性较好，可用于下一步试验。采用TaKaRa 公司的RT-PCR 试剂盒将提取的总RNA 通过反转录合成cDNA 的第1 链。利用特异性引物对PGA1 基因进行RT-PCR 扩增，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得约1.5 kb 的片段（图2）。回收该片段，与pEASY 克隆载体连接，然后将重组阳性质粒送至北京华大基因公司进行测序。

测序结果表明，试验获得的PGA1 基因的CDS序列长为1 497 bp，其中，（G＋C）含量占38.81%，（A＋T）含量占61.19%。NCBI 比对发现，克隆的基因序列与已报道PGA1 序列相似性达到99.2%，可能是由于克隆基因所用的品种差异造成的差别，利用MEGA 7.0 软件构建PGA1 遗传进化树发现，马铃薯PGA1 基因与潘那利番茄（Solanum pennellii）属于同一分支，亲缘关系最近（图3）。用Generunner软件推导获得PGA1 基因的氨基酸序列（图4），该基因编码498 个氨基酸。用ProtParam 对马铃薯PGA1 基因序列进行在线分析可知，该基因分子质量为57.087 ku，理论等电点为9.29，蛋白分子式为C2624H4104N678O696S25，PGA1 蛋白带完全正电荷的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸总和为63 个，带完全负电荷的谷氨酸与天冬氨酸总和为48 个，不稳定性系数为42.76（＞40），表明该蛋白是不稳定性蛋白。

2.2 蛋白质疏水性分析及蛋白质结构预测

马铃薯PGA1 蛋白的亲/ 疏水性预测通过ProtScale 在线软件进行分析（大于0 表示疏水性，小于0 表示亲水性），结果发现（图5），预测的最大值出现在第15 个氨基酸处，分值为3.167，疏水性最强；最小值出现在第146 个氨基酸处，分值为-3.000，亲水性最强。

使用SOPMA 在线软件对蛋白质二级结构进行预测分析，结果表明，PGA1 基因所编码的蛋白二级结构主要由α 螺旋、β 转角、延伸链和无规则卷曲4 部分组成，其中，261 个氨基酸可能参与形成α 螺旋，占52.41%；30 个氨基酸可能参与形成β 转角，占6.02%；64 个氨基酸可能参与形成延伸链，占12.85%；143 个氨基酸可能参与形成无规则卷曲，占28.71%，α 螺旋和无规则卷曲是其主要的二级结构元件，β转角和延伸链分散在整个蛋白结构中（图6）。

利用SWISS-MODEL 在线分析工具，对PGA1基因编码的蛋白三维结构进行预测。结果显示（图7），马铃薯PGA1 编码的蛋白的三维结构主要以α 螺旋和无规则卷曲为主，与二级结构预测结果相一致。

2.3 蛋白质跨膜区域、信号肽及亚细胞定位分析

采用PSORT 工具预测马铃薯PGA1 蛋白最有可能定位于内质网。利用TMHMM2.0 在线分析了马铃薯PGA1 蛋白的跨膜结构，结果发现（图8），该蛋白第30—498 位氨基酸位于细胞膜表面，第7—29 位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区，与该蛋白的疏水性区域分析结果一致，表明该蛋白可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。

通过SignalP 4.0 Server 软件系统在线分析了马铃薯PGA1 基因的信号肽序列，结果显示（图9），该蛋白的氨基酸序列不具备信号肽序列，是非分泌型蛋白。

3 结论与讨论

块茎中马铃薯糖苷生物碱含量过高会影响人畜安全，但其也存在积极作用。有研究表明，该类次生代谢物能够增强植物的抗病性、抗虫性等，是植物防御病虫害的化学屏障[18-19]。因此，科研人员育种时，最为理想的是获得马铃薯地上部分生物碱含量高而块茎中含量低的品种，而通过常规育种手段很难实现。

随着基因工程技术的快速发展，通过转基因技术调控糖苷生物碱的合成可为育种人员开辟一条新途径。目前，关于糖苷生物碱合成代谢研究的报道还比较缺乏，但部分合成代谢途径的关键基因及酶已取得了一定进展，如已经鉴定出同时调控α-茄碱合成的茄啶半乳糖转移酶基因SGT1 和SGT2，同时调控α- 卡茄碱的茄啶鼠李糖转移酶基因SGT2 和SGT3[20-22]，以及最新鉴定出的编码糖苷生物碱合成通路关键酶基因CYP450 单加氧酶基因等[23]。另外，在马铃薯糖苷生物碱的合成途径中，还有很多关键基因及酶发挥重要的调控作用，研究并了解这些合成代谢相关酶的功能机制具有非常重要的意义。

本研究通过对马铃薯栽培品种大西洋中糖苷生物碱合成关键酶PGA1 基因进行克隆，得到长为1 497 bp、编码498 个氨基酸的基因序列；进一步分析发现，马铃薯PGA1 蛋白主要分布在内质网。信号肽分析表明，马铃薯PGA1 蛋白不含信号肽，属于非分泌型蛋白。氨基酸序列进化分析结果表明，PGA1 与野生番茄资源潘那利番茄的亲缘关系最近，都是茄科作物，符合物种进化规律。

本研究通过对马铃薯PGA1 基因的克隆和初步分析，有利于对PGA1 基因编码蛋白的功能进行深入研究，有助于了解马铃薯糖苷生物碱的合成机制。今后将尝试通过基因编辑技术对PGA1 基因进行干扰，并通过根癌农杆菌介导遗传转化技术进行转基因马铃薯的研究，探讨通过基因编辑技术调控马铃薯糖苷生物碱含量的新技术。