河南省新生儿干血斑中11种氨基酸正常参考区间的建立

王艳丽 祁少可 张超楠 李乐瑶 李超杰 郭文文 刘新新 郝戈芳 李鹏威 孙小瑞

河南省人口和计划生育科学技术研究院，国家卫生健康委出生缺陷预防重点实验室，河南省人口缺陷干预技术研究重点实验室(郑州 ，450002)

串联质谱技术已广泛应用于新生儿遗传代谢病筛查。目前，实验室对筛查指标的评估主要依赖于丰华公司提供的参考范围，但各地区人群存在遗传背景差异，导致阈值各不相同。本研究对河南省22 811例新生儿血斑标本进行11种氨基酸检测，建立本省新生儿氨基酸的正常参考区间。

1 材料与方法

1.1 标本

收集2017年1月—2018年10月河南省各地区送本实验室筛查的新生儿干血斑标本，按照《新生儿遗传代谢病筛查》[1]的规定剔除未渗透，血斑面积不够及采血时间不足等标本，共计对22 811例标本进行筛查。

1.2 主要试剂和仪器

串联质谱仪(API 3200MD)， 恒温孵育振荡器(PerkinElmer)，数控超声波清洗器(KQ3200DE型)，多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(广州丰华医疗器械有限公司)。

1.3 方法

按照非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(广州丰华)说明书进行操作。使用打孔器对送检的血斑打孔，直径3mm，将血斑依次放入洁净的U型微孔板中。每孔加入含氨基酸内标的萃取液100 μl，使用粘性封板膜覆盖微孔板。30℃，650～750 rpm速度震荡(45±10)min。孵育完成后，每孔吸取75 μl内容物至V型底耐热微孔板对应孔中，使用铝箔封套覆盖微孔板，启动应用软件测量。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 筛查情况

在22811例接受遗传代谢病筛查的新生儿中，电话召回复查696例(3.05%)，阳性27人(0.12%)，确诊6人，死亡1人，筛查病种发病率为0.26‰。其中甲基丙二酸血症(MMA)3例，发病率为0.13‰；苯丙酮尿症(PKU)3例，发病率为0.13‰[2]。

2.2 11种氨基酸参考范围

剔除6例确诊阳性的患者，对22 805例标本进行分析。 对11项氨基酸检测结果正态分布检验均不符合正态分布 ，取P0.5～P99.5的值作为参考区间，从而得出河南省新生儿干血斑中11项氨基酸检测正常参考值，见表1。

2.3 与其他地区及试剂盒参考范围比较

随着新生儿遗传代谢病筛查的普及，许多地区都已经建立了各自的正常值参考区间[9-12]，具体对比见表1。

表1 河南及其他省新生儿干血斑11种氨基酸检测正常值参考区间(μmol/L)

3 讨论

遗传代谢病种类繁多，临床表现复杂多样，轻重不等，任何器官和系统均可受累，如代谢性酸中毒、毛发异常、急性脑病等[3]。因遗传代谢病临床症状缺乏特异性，目前临床也尚无常规生化检验指标，因此对新生儿遗传代谢病的诊断治疗存在较大难度。串联质谱技术1990年在美国首次用于新生儿遗传代谢病筛查，2003年上海市率先应用该技术对遗传代谢病进行筛查[4]。目前由于该项技术对各项要求较高(标本、技术，仪器、实验操作、试剂等)，并且国内尚未有统一的操作规范和参考区间，且各地区人群存在遗传背景的差异，从而导致阈值各不相同，所以各地区实验室应该根据自己的实际情况建立适合当地人群的参考区间。

本研究对河南省22 811例新生儿干血斑进行遗传代谢病筛查，其中PKU发病率(0.13‰)与之前报道的河南省发病率接近[5]；MMA发病率(0.13‰)也与之前报道的河南省的发病率比较接近[6]。

本研究在确定参考区间前，根据美国CLSI文件推荐的C28-A2要求[7]，对检测仪器进行性能评价，评价的关键指标为不准确度和不精密度。氨基酸低值质控C1各项指标对应的批内精确度ALA 4%、ARG 4%,CIT 5%、GLY 9%、LEU 5%、MET 5%、PHE 5%、PRO 4%、TYR 5%、VAL 5%)。氨基酸高值质控C2各项指标对应的批内精确度(ALA 4%、ARG 4%、CIT 4%、GLY 6%、LEU 4%、MET 4%、PHE 4%、PRO 4%、TYR 4%、VAL 4%)。本研究的检测系统经过验证，检测结果可靠。本研究对河南省22 805例新生儿干血斑中11种氨基酸进行分析，建立了该地区的正常值参考区间。对比丰华医疗器械有限公司提供的参考区间，PHE的切值差异较大，从116μmol /L降到了98.6μmol /L。这就意味着在对河南地区新生儿中进行高苯丙氨酸血症初筛判读时[8]，使用丰华公司提供的参考区间将会出现假阴性结果，需要引起足够重视。

随着串联质谱技术的推广，许多地区都已经建立了各自的正常值参考区间[9-12]，本文对河南省、陕西省和甘肃省的参考值范围，比较发现，这3个省干血斑中氨基酸含量的检测区间各不相同。首先选择正常参考区间的百分位数是造成差异的重要原因，如甘肃省的参考区间为P2.5～P97.5[10]，而本实验室的参考区间为P0.5～P99.5。目前《新生儿遗传代谢病筛查》建议百分位数的区间为(P0.5～P99.5)，统一的标准将更加方便室间的比较。其次筛查人群及居住地域差异等会导致各地区的发病率也各不相同，如PKU在北方地区发病率明显高于南方，这些因素也会导致参考区间的明显不同。此外，湿度、温度等气候变化也有可能引起检测结果的差异。因此每个实验室都应建立自己的参考区间。

本研究按照教材建议的参考区间，通过对22 805例新生儿串联质谱数据进行统计分析，建立了本地的正常值参考范围，有利于降低假阳性和假阴性率，提高阳性预测值，以期更好地辅助临床。