褪黑素联合顺铂促进大鼠胰腺癌AR42J细胞凋亡

庞林荣 陈俊 陆静尔 黄佳 徐彩虹 程晓春 李晖 周欣

浙江省宁波市鄞州人民医院肿瘤放化疗中心，宁波 315040

褪黑素具有多种生理功能[1]，它对肿瘤细胞有抗氧化性、抑瘤性和促凋亡活性，是抗癌剂或联合治疗的理想候选药物之一[2]。大多数化疗药物是线粒体介导的内源性凋亡途径的典型激活剂，且细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量蓄积可导致线粒体损伤进而诱导肿瘤细胞凋亡[3-4]。内源性凋亡途径始于caspase-9的激活，然后激活caspase-3、6和7，通过下游半胱天冬酶切割特定细胞底物蛋白质，促使细胞凋亡[5-6]。对癌症患者的初步临床研究表明，褪黑素可以降低肿瘤的复发率，延长患者生存时间[7]。然而，关于褪黑素与化疗药物联合应用对胰腺癌细胞凋亡的影响及机制目前尚不清楚。本研究观察褪黑素联合顺铂对大鼠胰腺癌细胞株AR42J细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。

材料和方法

一、细胞培养及分组

大鼠胰腺癌细胞株AR42J购于上海酶研生物科技有限公司，常规复苏、传代。实验分两部分，第一部分实验分为对照组、1 mmol/L顺铂处理组(顺铂组)、1 mmol/L褪黑素处理组(褪黑素组)、1 mmol/L顺铂加1 mmol/L褪黑素联合处理组(联合组)；第二部分实验分为对照组、联合组、1 μmol/L PBN(phenyl-N-tert-butyl nitrone，ROS抑制剂)预处理1h后顺铂加褪黑素联合处理组(PBN+联合组)、PBN溶剂预处理1h后顺铂加褪黑素联合处理组(溶剂+联合组)。药物处理浓度根据预实验筛选获得。

二、细胞增殖检测

使用MTT法检测细胞增殖活性，试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。取各组对数生长期细胞，以每孔2×106个细胞密度接种于24孔板，根据分组分别给予相应的药物处理。培养24 h后弃培养液，加入含MTT的培养液继续培养4 h，上酶标仪检测各孔490 nm波长的吸光度值(A490值)。每组设3个复孔，取均值。细胞增殖率=实验组A490值/对照组A490值×100%。

三、细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI 法检测细胞凋亡，检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。各组细胞药物处理24 h后，用含0.2%胰蛋白酶的EDTA分离细胞，PBS洗涤两次，1 000 r/min离心5 min后弃上清液，用含有V-FITC的95 μl缓冲液重悬细胞，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，上流式细胞仪(Cytomycs FC-500，美国Beckman-Coulter公司)测细胞凋亡。每个样本测试3次，取均值。

四、ROS水平检测

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测各组细胞内ROS水平，DCFH-DA购于美国Molecular Probes公司。取各组培养24 h的细胞，用PBS洗涤2次，加入无血清培养基中稀释的DCFH-DA，终浓度为20 μmol/L。在暗箱中37 ℃孵育30 min后用PBS洗涤细胞2次，上激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG，德国)测量荧光强度，激发光波长488 nm，发射光波长525 nm。

五、细胞caspase-3蛋白表达量检测

取各组培养24 h的细胞，用RIPA裂解液裂解细胞。蛋白定量后常规行蛋白质印迹法检测caspase-3蛋白表达量，以β-actin为内参。抗caspase-3 一抗购于英国Abcam公司，工作浓度1∶500，抗β-actin一抗购于美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶2 000， HRP耦联羊抗小鼠或山羊抗兔抗体购于英国Abcam公司，工作浓度1∶5 000。最后在暗室中采用ECL发光液(上海爱必信生物科技有限公司)发光，胶片曝光、显影、定影，扫描仪扫描胶片图像，用Image J软件分析各条带的灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白表达量，以对照组为1，计算其他组表达量的百分比。

六、统计学处理

结 果

一、褪黑素联合顺铂对细胞增殖和凋亡的影响

对照组、顺铂组、褪黑素组、联合组细胞培养24 h后的细胞增殖率分别为(96.29±3.49)%、(81.38±6.01)%、(80.72±3.68)%、(42.26±6.35)%；细胞凋亡率分别为(16.42±4.15)%、(56.47±9.06)%、(52.94±6.57)%、(87.36±6.48)%。顺铂组、褪黑素组的细胞增殖率较对照组均显著降低，细胞凋亡率均显著升高；联合组的细胞增殖率又较顺铂组、褪黑素组显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示褪黑素联合顺铂处理对大鼠胰腺癌AR42J细胞增殖抑制及凋亡的作用强于单独用药处理。

二、褪黑素联合顺铂对细胞ROS水平的影响

对照组、顺铂组、褪黑素组、联合组细胞培养24 h后ROS阳性细胞占比分别为(1.33±1.53)%、(46.67±7.64)%、(45.67±5.13)%、(83.33±7.64)%。顺铂组、褪黑素组ROS阳性细胞占比较对照组显著增加；联合组ROS阳性细胞占比又较顺铂组、褪黑素组显著增加，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示褪黑素联合顺铂处理促进大鼠胰腺癌AR42J细胞产生ROS，其作用强于单独用药。

三、褪黑素联合顺铂对细胞caspase-3表达的影响

对照组、顺铂组、褪黑素组、联合组细胞caspase-3表达量分别为100%、(150.64±7.70)%、(147.00±7.27)%、(190.04±5.07)%。顺铂组、褪黑素组细胞caspase-3表达量较对照组显著上调，联合组又较顺铂组、褪黑素组进一步显著上调，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图1)，提示褪黑素联合顺铂处理促进大鼠胰腺癌AR42J细胞caspase-3表达。

图1 对照组(1)、顺铂组(2)、褪黑素组(3)、联合组(4)细胞培养24 h后caspase-3表达

四、PBN预处理对褪黑素联合顺铂处理细胞ROS水平的影响

对照组、联合组、PBN+联合组、溶剂+联合组细胞培养24 h后ROS阳性细胞占比分别为(1.80±0.72)%、(84.90±6.13)%、(45.24±4.64)%、(86.23±6.17)%。联合组ROS阳性细胞占比较对照组显著增加，PBN+联合组ROS阳性细胞占比较联合组显著降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示褪黑素联合顺铂处理前给予ROS抑制剂PBN预处理可显著逆转褪黑素联合顺铂处理所致大鼠胰腺癌AR42J细胞内ROS水平。

五、PBN预处理对褪黑素联合顺铂处理细胞caspase-3表达的影响

对照组、联合组、PBN+联合组、溶剂+联合组细胞培养24 h后caspase-3表达量分别为100%、(184.69±7.76)%、(124.92±9.72)%、(182.02±6.79)%。联合组caspase-3表达量较对照组显著上调，PBN+联合组caspase-3表达量较联合组显著下调，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图2)，提示褪黑素联合顺铂处理前给予PBN预处理可显著逆转褪黑素联合顺铂所致大鼠胰腺癌AR42J细胞的caspase-3表达。

讨 论

大鼠胰腺癌细胞AR42J是来源于重氮丝氨酸诱导大鼠胰腺生成的恶性结节，是胰腺上皮癌变[8]。文献报道，褪黑素可促进胰腺癌、肝癌和前列腺癌细胞的凋亡[9-10]，增强多柔比星对正常非肿瘤细胞如人角质形成细胞的细胞毒性[11]。然而褪黑素对顺铂诱导的人外周血单个核细胞的细胞毒性具有保护作用[12]，也不干扰阿糖胞苷、柔红霉素和依托泊苷导致的白血病细胞系Jurkat、MOLT-4、Daudi、HL-60、CMK和K562的细胞凋亡[13]。

图2 对照组(1)、联合组(2)、PBN+联合组(3)、溶剂+联合组(4)细胞培养24 h后caspase-3表达

细胞凋亡是一个重要的生理过程，在发育和组织内稳态中起着关键作用。caspase-3的激活是细胞凋亡的重要条件[14]，然而细胞凋亡也涉及广泛的病理条件。凋亡缺陷是肿瘤发生的常见事件且是耐药的重要因素[15]，已知各种化疗药物可触发内源性凋亡途径和(或)增加线粒体对凋亡信号的敏感性[16-17]。

ROS包括超氧化物、单线态氧原子、过氧化氢、羟自由基和过氧化基等，可激活肿瘤细胞内信号转导通路，促进炎症反应、细胞周期进程、细胞凋亡、肿瘤细胞迁移和侵袭能力等[18]。过量的活性氧会损害细胞脂质、蛋白质和DNA[19]，细胞内ROS蓄积是触发细胞凋亡的内在途径的机制之一，且通常伴随着线粒体的损伤[20]。同时，ROS是内质网应激的重要调节因子，而内质网应激可触发未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)以保护肿瘤细胞免遭死亡[21]。许多天然药物和合成药物通过诱导ROS的产生而发挥抗肿瘤作用[22]。细胞氧化还原内环境平衡受到活性氧耗竭系统和活性氧清除系统之间平衡的调节[23]，例如，活性氧自由基(特别是H2O2)水平的升高具有很强的致突变性，有助于提高细胞突变水平和异质性，增加ROS水平可能导致细胞增殖抑制并最终导致细胞死亡[24]。因此增加ROS蓄积从而诱导癌细胞死亡是抗癌研究的重要方向。

本研究结果显示，褪黑素联合顺铂处理后AR42J细胞的增殖活性较单用褪黑素或顺铂处理时显著降低，而细胞凋亡率显著增加，同时细胞内ROS蓄积，caspase-3表达量上调。应用ROS拮抗剂PBN预处理后，使褪黑素联合顺铂处理的AR42J细胞内ROS水平下降，caspase-3表达下调，说明褪黑素联合顺铂可能通过ROS/caspase-3通路促进胰腺癌AR42J细胞的凋亡，为胰腺癌治疗和研究提供了新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突