以慢病毒为载体的人骨肉瘤细胞肾上腺髓质素RNA干扰体系的构建

戴星，杨康平，尹战海，马巍，杨益民，周晓玲，姚璐

(1西安交通大学第一附属医院，西安 710061；2西安交通大学医学部基础医学院)

骨肉瘤是临床上最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年及儿童，给社会和家庭造成极大负担。目前临床上骨肉瘤的治疗，一直在尝试改进化疗方案和外科术式，一定程度上提高了患者生存率，但骨肉瘤总的预后并未得到显著改善[1]。因此，寻找骨肉瘤恶性生物学行为的关键蛋白或关键基因，以阻断或延缓骨肉瘤的生长和远处转移，并指导临床治疗具有至关重要的研究和应用意义。肾上腺髓质素(ADM)是一种最初从人类嗜铬细胞瘤内分离出来的含有52个氨基酸的多肽，其结构与降钙素基因相关肽具有同源性[2]。最初研究发现，ADM在肾上腺髓质中大量富集，能引起机体的持续低血压反应。随着进一步的深入研究发现，ADM广泛分布于全身各处组织中，并且具有促血管生成[3]和促肿瘤生长作用[4]。骨肉瘤组织中ADM mRNA过度表达，ADM可能通过促进骨肉瘤中微血管的增生、部分缓解实体肿瘤的缺氧，从而促进骨肉瘤细胞的大量增殖，并有利于肿瘤局部浸润和转移[5]。因此，沉默ADM基因表达从而抑制骨肉瘤的生长也许是骨肉瘤治疗的一种新途径[6]。

RNA干扰(RNAi)技术因其作用稳定持久、特异而高效性受到广泛重视。成功进行RNAi实验的关键是设计并找到有效目标基因作用靶点，并在细胞内导入或者稳定表达shRNA。目前常用的主要有磷酸钙共沉淀、电穿孔法、阳离子脂质体法、病毒感染等。上述前三种方法在实际操作中插入目的基因的片断很短，转染效率相对较低，持续时间短且难以稳定表达shRNA片段，同时部分试剂存在较大的细胞毒性。因此本研究选择了病毒感染方法沉默ADM基因。2018年2～8月，我们采用慢病毒载体系统，根据RNAi的设计原则，构建了针对人骨肉瘤细胞ADM的慢病毒RNA干扰体系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 慢病毒、细胞、试剂和仪器 慢病毒载体体系(Genechem Co. Ltd. Shanghai, China)：由pHelper 1.0载体、GV-115载体和pHelper 2.0 载体三质粒组成。293T细胞株由中国科学院干细胞库提供。TaqPolymcrase、DNA ladder Marker购自Takara公司；QIAGENPlasmidKit购自Qiagen公司；AgeⅠ限制性内切酶、EcoRI限制性内切酶、T4 DNA-ligase连接酶、T4 DNA - ligase buffer缓冲液购自NEB公司；琼脂糖购自Biowest生物公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。1 mol/L CaCl2溶液：CaCl2·2H2O 17.7 g，去离子水100 mL。100 mg/mL氨苄青霉素：氨苄青霉素1 g，灭菌去离子水10 mL。分装-20 ℃保存，以25～50 μg/mL浓度添加于生长培养基。LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、去离子水800 mL、加入适量NaOH调整pH 7.5、去离子水定溶至1 000 mL，高压灭菌30 min。LB固体培养基：琼脂粉15 g，LB液体培养基1 L，高温高压灭菌。PCR仪和Realtime PCR仪(美国Bio-Rad公司)；高速离心机(Sigma公司)；高度冷冻离心机(Micro CL17R型，THERMO IEC公司)；Gilson移液器(吉尔森公司)。

1.2 靶向ADM shRNA的设计 人类ADM mRNA的GENE BANK的序列号为NM_001124，根据其设计靶向ADM的shRNA候选序列3条，分别命名为shRNA-1、2、3，同时制备无意义链shRNA-scr作为对照，具体序列如下：shRNA-1:F:5′-CCGGGGAGGTAGGACTAACAAT-AAACTCGAGTTTATTGTTAGTCCTACCTCCTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAACTGGTGTCTTCTAAGCCACAACT-CGAGTTGTGGCTTAGAAGACACCAG-3′；shRNA-2:F:5′-CCGGCCCTAAACCATGGTTCTAAACCTCGAGGTTTAG-AACCATGGTTTAGGGTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAA-GATCTACCAGTTCACAGATAACTCGAGTTATCTGTGA-ACTGGTAGATC-3′；shRNA-3:F:5′-CCGGACATCCTTA-TCGACCTCAATCCTCGAGGATTGAGGTCGATAAGGAT-GTTTTTTG-3′，R:5′-AATTCAAAAACCGCCAGAGCATG-AACAACTTCTCGAGAAGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3′；shRNA-scr:F:5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA-AGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，R:5′-A-ATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAA-CGTGACACGTTCGGAGAA-3′。设计好的序列合成相应的DNAoligo单链，退火形成具有粘性末端的DNA双链。将所得ADM-shRNA冻干粉剂用Rnase-free水配制成20 μmol/L的贮存液，分装后置于-20 ℃保存。

1.3 靶向ADM shRNA与慢病毒载体的连接、鉴定 用限制性内切酶Agel和EcoR Ⅰ进行双酶切后，使GV-115载体线性化。使用Fermentas T4连接酶，将酶切后的载体与DNA oligo进行连接，形成重组慢病毒GV-115载体。CaCl2法制备感受态大肠杆菌，将需转化的质粒片段转化至感受态大肠杆菌中，菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上行定向筛选，37 ℃培养过夜。挑选LV-ADM-shRNA 1、2、3阳性克隆进行PCR鉴定(PCR引物序列：上游引物5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游引物5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’； PCR反应体系：dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μL，10×buffer 2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，Taq polymerase 0.2 μL，补足ddH2O至总体积为20 μL。温度循环程序：72 ℃加热6 min，85 ℃加热30 s，94 ℃加热30 s，其中85 ℃至94 ℃共30个循环)，经PCR鉴定证实质粒连接正确。3组shRNA序列送上海吉凯公司进行测序确认。

1.4 目的质粒的抽提、慢病毒包装、慢病毒滴度的测定 保留鉴定成功的携带目的质粒的E.coli DH5α工程菌，蘸取少量菌液于5 mL BD摇菌管中摇菌8 h，随后吸取2 mL小摇的菌液于500 mL LB生长培养基中继续摇菌过夜扩大培养，次日使用DNA分离柱进行质粒的抽提。选择状态良好的293T细胞，加入20 μg 重组慢病毒GV-115载体，15 μg pHelper 1.0载体，10 μg pHelper 2.0载体，与同体积的转染试剂Lipofectamine 2000混合均匀，调整总体积为1 mL。混合液缓慢加入细胞培养液中，于细胞培养箱中培养行慢病毒的包装。更换为完全培养液培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心、过滤取病毒浓缩液。采用多孔稀释法测定慢病毒的滴度。测定前1天，将测定滴度所需的293T细胞铺96 孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100 μl。每8孔为一组更换成含8 μg/mL聚凝胺的完全DMEM，90 μL/孔，第一孔加入待测病毒原液10 μL，混匀后吸出10 μL加入第2孔，以此类推，倒数第2列内10 μL弃去，最后一列为对照组，5组复孔。32 ℃、1 000 g离心60 min。37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，48 h后按病毒浓度由高至低观察，确立计量孔，在荧光显微镜下观察并计数出现绿色荧光的细胞数。 根据如下公式计算病毒滴度：病毒滴度(TU/mL)=m×10n+1(m为最后一阳性计量孔阳性细胞数,n为出现绿色荧光细胞的计量孔数)。

2 结果

2.1 构建的LV-ADM-shRNA载体的鉴定、测序结果 已成功连接LV-ADM-shRNA载体的阳性克隆PCR片段为350 bp，而未连接shRNA的空载体克隆PCR片段为306 bp(见图1)，载体连接情况符合预期设计。3组shRNA序列经测序确认合成的寡核苷酸插入部位正确。

注：1：阴性对照ddH2O；2：空载体自连对照组；3：Marker；4～8：转化子鉴定，其中部分产物低于正常转化子高度的为阴性克隆。Marker自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 图A、B、C为LV-ADM-shRNA 1、2、3。

图1慢病毒载体LV-ADM-shRNA阳性克隆PCR产物电泳图

2.2 LV-ADM-shRNA质粒转染293T细胞慢病毒滴度测定结果 使用不同浓度的慢病毒原液进行梯度浓度转染后，荧光显微镜下观察到的细胞荧光照片如图2所示。根据以下荧光图片中绿色荧光蛋白GFP 的表达情况，在加入1×106μL慢病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个慢病毒颗粒感染了细胞，慢病毒滴度为2×109TU/mL。

注：A:加入10 μL病毒原液；B:加入0.1 μL病毒原液；C:加入1×10-3μL病毒原液；D:加入1×106μL病毒原液。

图2不同浓度的病毒原液转染293T细胞的荧光图像(100×)

3 讨论

ADM为一个潜在的肿瘤血管生长因子，可以刺激骨肉瘤新生微血管的增生，缓解骨肉瘤内部的缺氧状态，通过探讨DM在骨肉瘤发生发展中的作用，将为骨肉瘤的诊断与治疗等提供一个新的分子生物学指标，而建立以ADM为核心的治疗方案很有可能成为治疗骨肉瘤的新途径。因此，本实验选择以人骨肉瘤细胞的ADM为作用靶点，建立以慢病毒为载体的RNA干扰体系，实现高效抑制ADM基因表达。RNAi是一种特殊而神奇的基因沉默现象，是通过双链RNA抑制目的基因的翻译或转录来实现抑制目的基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi是体内抵御外在感染的一种重要保护机制，病毒自身基因组所包含的或在病毒复制过程中产生的双链RNA可以被Dicer识别，从而引起病毒RNA降解[7]。同时RNAi也是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转录子活性的重要方式，转录子通常以逆转录的方式在基因组中扩增，在逆转录过程中产生的双链RNA分子同样可以被Dicer识别，从而被降解[8]。

常用的病毒载体主要有RNA病毒载体和DNA病毒载体两类，RNA病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒；DNA 病毒包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。目前操作技术最成熟，实际操作常用并能实现高效转染的是慢病毒载体。慢病毒属于逆转录病毒的一种，是人类免疫缺陷病毒-1来源的一种病毒载体。相比于其他病毒，慢病毒有两个突出优点：①可以整合到靶细胞的基因组，能够较长时间持续表达；②经过慢病毒系统的包装和改造后，可以感染人的绝大多数细胞，即使是未处于分裂期的细胞仍然可以高效感染。另外，与逆转录病毒比较，慢病毒的基因组更复杂，所以它的复制周期也更长。除去与逆转录病毒的相同基因组结构外，慢病毒还有在其复制周期中起着重要作用的辅助基因，如Tat、Rev是其病毒基因高效表达所必需的。Tat激活LTR区的启动子从而使病毒RNA链得以有效延伸。Rev通过与病毒RNA链上的rre相互作用，促进未完全剪切的病毒mRNA输出到细胞核外，以便于被细胞质中的剪切因子剪切变成成熟mRNA从而表达病毒蛋白[9]。在临床基因治疗实践中，由于很多靶细胞属于非分裂细胞，因而逆转录病毒的应用受到很大限制，但慢病毒可以感染非分裂细胞，感染那些在G0到G1b期就可以完整有效完成病毒基因组转录的非分裂细胞，因而慢病毒载体在临床基因治疗中拥有广阔的前景[10～13]。

本研究中采用慢病毒载体作为实施RNAi的工具，对ADM基因实施高效特异性抑制。通过构建慢病毒载体，设计3条针对ADM基因靶序列的shRNA序列，根据PCR结果判断，靶向ADM shRNA与GV115载体连接情况符合预期设计，即经测序确认合成的寡核苷酸插入部位正确。为保证载体携带的目的基因的表达效率，需要获得具有较高滴度的病毒。病毒滴度取决于具有感染能力的病毒颗粒与无感染能力的病毒颗粒的比例。利用病毒包装技术所得的慢病毒滴度在理论上可达108～109TU/mL，但是在实际试验操作中获得的病毒滴度常低于108/mL。为了得到病毒滴度更高的病毒包装系统，本研究通过对病毒包装的辅助结构以及载体结构进行了优化，现已能获得滴度高达2×109TU/mL的慢病毒表达载体。主要优化方法如下：①对GV-115载体进行改造，以Agel和EcoR Ⅰ双酶切得到线性化质粒，同时加入rev基因编码调节因子，促使gag-pol基因及其融合蛋白表达，提高病毒的包装效率；②病毒载体mRNA的丰裕度以及包装信号序列长度对病毒滴度水平具有重大影响，本研究使用了全长mRNA以及经过扩展的包装信号序列。经过上述改进方法包装的病毒，经滴度测定，获得较高滴度(2×109TU/mL)的慢病毒颗粒，为后续实施ADM基因的沉默，在体实验中观察对骨肉瘤的抑制效果奠定了实验基础。