类风湿关节炎患者血清长链非编码RNA-Hox转录反义RNA表达变化及其意义

铁宁,王勇,满大夫,于洋

(内蒙古医科大学附属医院,呼和浩特010059)

类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫介导的慢性炎症性疾病，病理上主要表现为滑膜炎、血管翳，造成全身性关节滑膜、关节软骨和骨质破坏，可引起患者关节畸形和功能丧失[1]。研究[2]表明，非蛋白编码RNA参与广泛的生物学和病理学过程，如细胞增殖、凋亡、炎症和自身免疫过程。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA调控分子，研究[3]表明，LncRNA在肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病等疾病中均存在异常表达的现象，有可能成为疾病诊断及治疗的生物学靶点。Chang等在2007年首次发现一种新的LncRNA即Hox转录反义RNA(HOTAIR)，长度约2.2 kb，位于人类染色体12q13.13上，在恶性肿瘤、RA及帕金森病等多种疾病的发生发展中起调节作用[4],但目前有关LncRNA-HOTAIR在RA中的表达变化及意义方面的研究较少。本研究观察了LncRNA-HOTAIR在RA患者血清中的表达变化，分析其与患者临床参数的关系，并探讨了其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年1月～2018年12月内蒙古医科大学附属医院收治RA患者132例(RA组)，均符合2010年美国风湿病协会/欧洲抗风湿病联盟的RA诊断标准[5]。纳入标准：年龄均>18岁；28个关节疾病活动指数(DAS28)[6]>2.6；患者及家属对本研究知情同意并签字。排除标准：外伤、感染等因素导致的关节肿痛；合并系统红斑狼疮等其他自身免疫性疾病；合并心肝肺肾等重要脏器功能不全。其中男29例、女103例，年龄21～73(51.1±10.7)岁，病程2～36(23±7.8)个月；疼痛关节数<5个60例、>5个72例，肿胀关节数≤6个56例、>6个76例；病情低度活动(DAS28>2.6～3.2)36例，病情中度活动(DAS28 3.2～5.1)37例，病情高度活动(DAS28>5.1)59例。以50例同期体检健康者作为对照组，男11例、女39例，年龄21～78(49.7±9.4)岁，患者均无自身免疫性疾病史。两组性别、年龄有可比性。

1.2 血清LncRNA-HOTAIR的检测 采用 qRT-PCR法。取研究对象(RA组入院第二天,对照组入院当天)清晨空腹静脉血3 mL，置于枸橼酸钠抗凝管中，3 000 r/min，4 ℃离心10 min，后取上清液，-80 ℃冰箱保存待测。应用TRIzol法提取血清中总RNA，提取步骤严格按照血清RNA提取试剂盒说明书(Qiagen公司)进行。以总RNA为模板，用反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录，合成cDNA，紫外分光光度计鉴定cDNA浓度及纯度，-20 ℃冰箱保存。应用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒、qRT-PCR检测LncRNA-HOTAIR。LncRNA-HOTAIR：上游引物序列:5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物序列：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′，内参基因GAPDH上游引物序列:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物序列:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。总反应体系20 μL，上下游引物各1 μL，模板4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 2 μL，DEPC水补足体系20 μL。qRT-PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。反应均在ABI7900实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。各组LncRNA-HOTAIR基因的循环阈值(CT)减GAPDH的CT值为ΔCt值，用2-ΔΔCt表示LncRNA-HOTAIR基因的相对表达量。

1.3 血清抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、类风湿因子(RF)、CRP、ESR的检测 取研究对象(RA组入院第二天,对照组入院当天)清晨空腹静脉血,采用ELISA试剂盒检测CCP抗体，结果>15 U/mL为阳性，试剂盒购自德国欧蒙公司，检测仪器为全自动酶标仪。采用速率散射比浊法检测RF、CRP，RF>20 U/mL为阳性，CRP>8 mg/L为阳性，试剂盒购自上海川翔生物公司，应用日立7600全自动生化分析仪检测，严格按照试剂盒说明书步骤操作。采用魏氏法检测ESR，结果>15 mm/h为阳性。

2 结果

2.1 各组血清LncRNA-HOTAIR水平及其他炎性指标比较 RA组 LncRNA-HOTAIR、抗CCP抗体、RF、 CRP、ESR水平分别为2.021±0.312、(211.5±132.6)U/mL、(39.2±5.3)U/mL、(13.16±4.7)mg/L、(21.2±4.6)mm/h，对照组分别为1.551±0.202、(10.1±2.1) U/mL、(8.1±3.6)U/mL、(3.1±0.7)mg/L、(8.2±3.2)mm/h。两组上述指标比较，t分别为11.924、17.445、45.268、23.902、21.515，P均<0.01。

2.2 RA组血清LncRNA-HOTAIR水平与患者临床参数的关系 RA组病情高度活动者血清LncRNA-HOTAIR的相对表达量高于中度及低度活动者(P<0.05)，而中度与低度活动者比较，P>0.05；RA组患者血清LncRNA-HOTAIR水平与DAS28呈正相关(r=0.645，P=0.009)。血清LncRNA-HOTAIR水平与RA患者性别、年龄、病程、疼痛关节数、肿胀关节数、RF、CRP、ESR及抗CCP抗体无相关性(P均>0.05)。见表1。

2.3 血清LncRNA-HOTAIR水平对RA的诊断价值血清LncRNA-HOTAIR水平诊断RA的ROC AUC为0.706(95%CI：0.573～0.839，P=0.004)，最佳诊断界值为1.819时，灵敏度、特异度、准确度分别为0.71、0.82、0.78；详见图1。

表1 血清LncRNA-HOTAIR水平与RA患者临床参数的关系

图1 血清LncRNA-HOTAIR水平诊断RA的ROC

3 讨论

RA是慢性、特发性的自身免疫性疾病，特征为多关节滑膜炎，关节软骨退化及边缘骨质侵蚀，并引起关节肿胀、疼痛、功能丧失和僵硬，严重影响患者的健康和生活质量。有研究[7]显示LncRNAs可通过多种机制调节基因表达，如表观遗传学修饰、选择性剪接，小RNA分子海绵以及转录和翻译调节。LncRNA可通过调控核因子-κB和Toll样受体信号传导通路的信号传导参与调节细胞因子表达、免疫细胞的增殖和分化及炎症过程，在多发性硬化症、系统性红斑狼疮、I型糖尿病和RA等多种自身免疫性疾病中发挥重要的调控作用[8]。

HOTAIR是长约2.2 kb的LncRNA，由RNA聚合酶II经转录、剪接、多腺苷酸化和5′-端加帽等过程合成。人类HOTAIR由6个外显子组成，也存在于其他哺乳动物如小鼠和大鼠中。有研究表明LncRNA-HOTAIR能够通过反式作用调节基因表达，如LncRNA-HOTAIR与PRC2(含有H3K27甲基化酶EZH2和其他亚基)相互作用并作用于HOXD基因，导致H3K27-三甲基化和HOXD基因表达沉默，而在siRNA敲除LncRNA-HOTAIR基因表达后，HOXD基因H3K27-三甲基化标记丧失[9]。近年有研究[10]表明，RA局部微环境中巨噬细胞、树突状细胞等炎性细胞LncRNA-HOTAIR表达上调，LncRNA与信使RNA相比更为稳定，可进入RA局部炎症微环境及外周血中，促进破骨细胞及滑膜细胞中MMP-2和MMP-13的表达，促进骨和软骨基质的溶解，导致关节破坏，最终促进RA的发展。因此研究HOTAIR在RA患者血清中的表达可能具有重要的临床意义。

目前临床上诊断RA主要依赖患者临床表现、影像学检查及血清学检查，特别是血清学指标检查在RA的诊断中具有重要的临床意义。RF在RA的诊断中应用较早，但在系统性红斑狼疮、肿瘤中可能存在假阳性，因而单独依赖RF诊断容易造成误诊或漏诊。RA是一种慢性炎症性疾病，ESR和CRP是临床上反映炎症活动程度的重要检查指标，虽然有助于反映RA炎症感染的状态，但诊断RA的特异性不高。抗CCP抗体是环状聚丝蛋白多肽片段，以IgG型为主，其诊断RA的敏感性与RF相似，但特异性较RF高，有助于RA的早期诊断和病情判断。本研究中，RA组患者血清LncRNA-HOTAIR、RF、CRP、ESR及抗CCP抗体明显高于对照组，表明检测血清LncRNA-HOTAIR、RF、CRP、ESR及抗CCP抗体均有助于RA疾病的诊断。RA患者血清LncRNA-HOTAIR水平升高，其原因可能是在脂多糖等因素作用下局部微环境处于炎症状态，局部免疫细胞如巨噬细胞、CD4+T细胞等能产生IL-17、IL-23、TNF-α等促炎性细胞因子，一方面能促进关节滑膜细胞内NF-κB信号通路活化，诱导MMPs等基因的表达，导致关节破坏，另一方面，促炎性细胞因子招募循环血中单核细胞向关节内迁移，而单核细胞中LncRNA-HOTAIR的表达较高，释放入血后引起血清LncRNA-HOTAIR水平升高[11]。DAS28是评估RA疾病活动性的综合指标，其内容包括关节疼痛和肿胀数、实验室指标ESR及患者健康状况，是目前监测RA疾病活动性及治疗有效性良好指标。本研究中，RA组病情高度活动者血清LncRNA-HOTAIR的相对表达量高于中度及低度活动者，血清LncRNA-HOTAIR水平与DAS28呈正相关，表明检测RA患者血清LncRNA-HOTAIR有助于疾病活动性判断，血清LncRNA-HOTAIR有可能作为RA早期诊断和判断活动性的分子标志物。本研究进一步应用ROC分析血清LncRNA-HOTAIR水平对RA的诊断价值，结果显示血清LncRNA-HOTAIR诊断RA的ROC AUC为0.706，敏感度为71%，特异度为82%，表明血清LncRNA-HOTAIR水平对RA诊断具有较高的敏感度和特异度，有可能成为新的RA诊断生物标志物。LncRNA-HOTAIR不容易被RNA酶降解，性质稳定，应用普通PCR即可检测，因而敏感性较高。研究[12，13]表明，对RA患者应用两种不同的生物制剂(Tocilizumab和Adalimumab)治疗后，LncRNA芯片结果中差异表达的LncRNA无重叠，表明不同生物制剂治疗后可通过影响特定的LncRNA发挥治疗作用。

综上所述，RA患者血清LncRNA-HOTAIR水平升高，其表达水平与疾病活动程度有关。检测血清LncRNA-HOTAIR的水平对于诊断RA具有较高的敏感性和特异性。RA患者血清LncRNA-HOTAIR有可能成为潜在的RA诊断和治疗靶点，但目前LncRNA-HOTAIR在RA发生发展机制中的调控作用尚不清楚，有待进一步深入研究。