JunD在浸润性乳腺癌分子亚型中的表达及意义

代新珍，米贤军，钟守军，段立锋，杨伟洪，刘祥玉，徐秀梅，黄兆华

（中山市博爱医院病理科，广东中山 528403）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率有上升并有年轻化的趋势，占女性肿瘤死亡原因的第二位。目前研究发现乳腺癌的发生、发展是一个极为复杂的过程，其中癌基因的活化、抑癌基因缺乏起主导作用。近年来随着对AP-1 家族成员研究的不断深入，发现其参与肿瘤的形成、侵袭和转移等生物学过程，而JunD 作为AP-1 家族成员中重要的一员，很多研究预测并提示JunD基因参与肿瘤的增殖、分化与凋亡，并在乳腺癌的发生发展中充当重要角色［1-2］。然而目前国内外对于JunD 在乳腺癌组织中的表达及具体作用的研究鲜有报道。本研究应用免疫组织化学方法（SP 法）检测JunD 在浸润性乳腺癌分子亚型及乳腺良性恶性病变中的表达情况，分析其差异表达与临床的相关性，期望为浸润性乳腺癌分子亚型的临床治疗及乳腺良恶性病变的鉴别诊断提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

随机抽取2013 年7 月至2019 年7 月经手术切除且经我科3 位病理医生证实的乳腺增生性病变191 例（乳腺腺病48 例，纤维腺瘤40 例，普通型导管增生30 例，乳头状瘤20 例，乳腺不典型增生20 例，导管原位癌33 例），20 例正常乳腺组织作为对照，乳腺浸润性导管癌160 例。其中乳腺浸润性导管癌患者中位年龄49（28～80）岁；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ期分别有52、108 例；组织学分级Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ级分别有17、143 例；有淋巴结转移62 例，无淋巴结转移98 例；乳腺癌患者中术后标本肿物直径≤2 cm 的78 例，肿物直径＞2 cm 的82 例。依据2013 St Gallen 国际乳腺癌会议分子亚型标准共识［3］，乳腺癌分为Luminal A 型22 例，Luminal B 型（Her2-）23 例，Luminal B 型（Her2+）69 例，Her2 受体阳性型28 例，TNBC 亚型（basallike）18 例。所有乳腺癌患者均是首次住院行肿块切除术，未做放疗、化疗及内分泌治疗，也未进行腋窝淋巴结活检手术以及腋窝的其他手术，均行乳腺癌改良根治术或乳腺肿物切除术，术前临床资料完整。所有患者均签署知情同意书。本研究经本单位伦理委员会审核同意免伦理审批。

1.2 试 剂

兔单克隆抗体JunD 购自abcam 及SP 试剂盒购自罗氏公司。

1.3 免疫组织化学

JunD 抗体工作浓度为1∶300。用PBS 液代替第一抗体作阴性对照。主要步骤：采用免疫组织化学SP 法染色，按说明书操作。以pH 6.0 的拘缘酸盐缓冲液微波修复抗原，滴加1∶300 JunD 单克隆抗体80 μL，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，试剂盒赠送的阳性片作为阳性对照，4 ℃过夜孵育；PBS 洗后，滴加过氧化酶标记的二抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗后，DBA 显色；苏木素复染、脱水、透明、中性树脂封片。

1.4 阳性结果判断

ER、PR、HER2 判定根据《乳腺癌HER2 检测指南（2014 版）》［4］；ER、PR、Ki67 定位于细胞核，HER2定位于细胞膜。JunD定位于细胞核，判断方法为在镜下观察，根据棕色反应的阳性强度及面积判断结果。采用二级积分法：阳性细胞数≤5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，≥75%为4分；染色强度淡黄色为1分，黄或棕黄色为2分，棕黄色为3分；最后计算两者得分相乘，阅片采用双盲法读片。本标本中染色一般为棕黄色，表达差异主要在于表达范围的不同，结果得分大致分布在0～4 分与9～12 分区间，故本实验以两者得分相乘≥9 分判读为阳性（即表达范围大于50%判读为阳性）。阅片采用双盲法读片。

1.5 统计学处理

全部统计分析用SPSS 19.0完成。两组样本间为分类资料，理论数字均大于5，故均采用四格表非校正卡方检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JunD 在乳腺组织中的表达

JunD 在乳腺组织的表达定位于细胞核，染色一般为棕黄色，表达差异主要在于染色范围的不一致，其在乳腺组织中的代表性染色见（图1）。160 例浸润性乳腺癌组织中JunD 阳性表达率为45.6%（73/160），20 例乳腺正常组织中JunD 阳性表达率为100%（20/20），48 例乳腺腺病中JunD 阳性表达率87.5%（42/48），30 例乳腺纤维腺瘤中JunD 阳性表达率90.0%（27/30），30 例乳腺普通型导管增生中JunD 阳性表达率90.0%（27/30），20 例JunD 乳腺导管内乳头状瘤中JunD 阳性表达率95.0%（19/20），20 例乳腺导管上皮不典型增生中JunD 阳性表达率90.0%（18/20），33 例乳腺导管原位癌中JunD 阳性表达率87.9%（29/33）。比较不同病理类型中JunD 的表达发现，JunD 在浸润性导管癌中的表达水平明显低于正常乳腺组织及乳腺导管上皮增生性病变中的表达，差异有统计学意义（P=0.000），正常乳腺组织与乳腺导管上皮增生性病变中JunD 表达均较高，两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05；表1）。

图1 JunD 在不同的乳腺组织中有代表性的染色情况Fig.1 Representative immunohistochemicai staining of JunD in different breast tissues

2.2 JunD 的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

JunD 在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率为45.6%（73/160），在组织学Ⅰ级与Ⅱ级+Ⅲ级之间（阳性表达率分别是82.4%、41.3%，P=0.001），差异有统计学意义（P＜0.01）；在患者年龄≤50 岁与＞50岁之间（阳性表达率分别是47.4%、42.9%，P=0.571），在肿瘤直径≤2 cm 与＞2 cm 之间（阳性表达率分别是44.9%、46.3%，P=0.852），肿瘤TNM 分期中Ⅰ期与Ⅱ+Ⅲ期之间（阳性表达率分别是46.2%、45.4%，P=0.926），在腋窝淋巴结无转移与转移之间（阳性表达率分别是51.6%、46.9%，P=0.564），在ER 阳性与阴性之间（阳性表达率分别是43.9%、50.0%，P=0.480），在PR 阳性与阴性之间（阳性表达率分别是47.4%、42.9%，P=0.571），差异均无统计学意义（P＞0.05；表1）。

2.3 JunD 在Luminal A 型、Luminal B 型、Her2 受体阳性型和TNBC 亚型中的表达

JunD 在各分子亚型中的表达情况见（图2），结果如下：Luminal A 型阳性表达率为40.9%（9/22），Luminal B 型（Her2-）阳性表达率为30.4%（7/23），Luminal B 型（Her2+）阳性表达率为49.3%（34／69），Her2 受体阳性型阳性表达率为32.1%（9/28），TNBC 亚型阳性表达率为77.8%（14/18，表1）。不同分子亚型两两相比较发现，与TNBC亚型相比较，Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2 受体阳性型中JunD 的阳性表达明显较低，差异有统计学意义（P=0.019，P=0.003，P=0.030，P=0.003），其余各亚型之间比较差异均无统计学意义（P＞0.05；表2）。

表1 JunD 蛋白在不同的乳腺组织中的表达情况及与临床病理指标的关系Table 1 The expression of JunD in different breast tissues and its clinical significance

3 讨论

乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，其发病的相关分子机制尚未明确，其发生发展是一系列基因共同协作的渐进性累积过程。随着分子生物学领域的发展，越来越多的生物标志物被发现，为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据。

图2 JunD 在浸润性乳腺癌不同分子亚型中有代表性的染色情况Fig.2 Representative immunohistochemical staining of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

表2 JunD 在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达Table 2 The expression of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

JunD 蛋白是由JunD 基因编码，由347 个氨基酸组成的分子量约为35 ku 的AP-1 转录因子。JunD 作为AP-1 家族成员中重要的一员，JunD 参与肿瘤的增殖、凋亡及分化，在肿瘤的形成过程中起着重要作用［5］。国外研究［6-8］发现在T 细胞淋巴瘤、B 细胞淋巴瘤及恶性胶质瘤的癌细胞中，JunD的蛋白呈现出异常表达；在人类口腔癌、前列腺癌及胃肠道肿瘤中，JunD 均有其相关的基因作用机制调控肿瘤的进展［9-11］。以上文献显示JunD 通过各种调控机制在各种恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，然而对于JunD 在乳腺癌中的研究鲜少见。本研究发现JunD 在浸润性乳腺癌中表达水平明显低于乳腺正常组织及乳腺增生性病变中的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），提示JunD 有助于维持乳腺组织正常生长，JunD 表达缺失促进肿瘤的发生。Toullec［12］等研究提示JunD 的表达缺失激活了肿瘤反应基质，促进乳腺癌的发生，JunD 在乳腺癌中低表达，本研究结果与Toullec 是一致的。JunD 蛋白协调细胞正常增殖、分化及转化等过程，下调JunD 会影响细胞的正常成熟和分化，促进细胞增殖；JunD 能够阻遏Ras 介导的癌化过程，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，激活细胞分化［13-15］。本研究结果也发现JunD 在浸润性乳腺癌组织学Ⅰ级（高分化）中的阳性表达水平明显高于组织学Ⅱ级-Ⅲ级组（中-低分化），表明了JunD的表达与肿瘤恶性程度有关，随着恶性等级增高，其阳性率逐渐降低，JunD 高表达的乳腺癌细胞分化往往较好，JunD 在乳腺癌中是预后较好的指标，与上述文献预测一致。本研究其他结果发现JunD在乳腺癌中的表达与肿物直径大小、年龄、淋巴结转移、ER、PR 及临床分期无关（P＞0.05），结果与目前文献报道有一点差异。Chen 等［16］发现在体外人类乳腺癌细胞株中，JunD 蛋白与JunB蛋白协同作用，选择性降低芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成，而本研究发现JunD 的表达与ER、PR 的表达无明显相关；Detry 等［17］发现在人类乳腺癌细胞株MCF-7 中，JunD 蛋白能识别并结合BSP 启动子的cAMP 应答原件（cAMPresponse element，CRE），过表达JunD 增强BSP 启动子活性，上调BSP 的表达，促进乳腺癌的发生及骨转移，而本研究结果提示JunD 的表达与淋巴结转移无关。这些差异可能与JunD 一大特点有关即为在所有的细胞类型中JunD 都是组成性表达，上述研究都是在体外细胞系中JunD 对细胞迁移及雌激素的影响，而在乳腺癌患者复杂体系中可能存在其他JunD 相关基因组成性表达，例如通过激活乳腺癌标志物LY6K 的表达进而促进乳腺癌转移，降低生存率［2］，进而导致结果有一些差异，JunD 在浸润性乳腺癌中的这些具体相关机制有待后期进一步研究。

JunD 在浸润性乳腺癌分子亚型的中的表达情况及相关作用，国内外文献报道较少见。Wayne 等［18］发现浸润性乳腺癌TNBC 亚型/basallike 中总是会出现JunD 高表达，JunD 在TNBC 亚型中可能起着重要作用。有研究者［19-20］发现50%浸润性乳腺癌TNBC 亚型存在各种各样的角蛋白的高表达，JunD 存在其中一种角蛋白KRT5 的结合位点，他们常常组成性高表达，JunD 的高表达激活了TNBC 亚型中TGFBR3-JUND-KRT5 信号通路等，JunD 在TNBC 亚型中充当重要角色。本研究也发现JunD 在TNBC 亚型阳性表达率高达77.8%，而在Luminal A 型为40.9%，Luminal B 型（Her2-）为30.4%，Luminal B 型（Her2+）阳性表达率为49.3%，Her2 受体阳性型为32.1%。两两比较，TNBC 亚型表达水平明显高于Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2受体阳性型中的表达，相比差异有统计学意义（P＜0.05），其余各亚型之间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。这与上述文献的研究结果是一致。2013 年St Gallen［3］国际乳腺癌会议共识将 乳腺癌 分为5 型：Luminal A 型，Luminal B 型（Her2-），Luminal B 型（Her2+），Her2 受体阳性型，TNBC 亚型（basal-like），该分类方法更精确的反应乳腺癌的生物学行为，提高了预后判断的准确性，有利于个体化治疗。Luminal A 型及Luminal B型可以化疗和内分泌治疗，预后较好；Her2 受体阳性型目前可以分子靶向治疗；而TNBC 亚型恶性程度高，容易复发及转移早，内分泌治疗效果差，缺乏有效的分子靶向治疗，预后很差。汤谧等［21］研究提出Runx2 树突状细胞基因疫苗可能可以特异性杀伤TNBC 亚型细胞，对其个性化治疗中起到一定的作用，但目前对于这种的靶向治疗尚不完善，缺乏有效可行的方法。所以我们认为，对于目前相对缺乏治疗方法的浸润性乳腺癌TNBC亚型来说，JunD在其中的高表达为靶向治疗提供了一定的研究方向，深入研究JunD 在TNBC亚型中的作用机制，有可能为浸润性乳腺癌TNBC亚型的个性化靶向治疗提供一定的帮助。

综上所述，JunD 在乳腺癌中的阳性表达率为45.6%，明显低于乳腺增生组织及正常乳腺组织，联合检测JunD 在乳腺组织中的表达情况，有利于乳腺良恶性病变的鉴别诊断。JunD 在浸润性乳腺癌TNBC 亚型中显著高表达，有望为TBNC 亚型乳腺癌患者个性化靶向治疗研究提供一定方向，但其相关分子机制有待进一步研究。

衷心感谢陈昂副主任医师帮忙审核统计方法；衷心感谢陈志强副主任技师指导切片及染色。