不同年龄小鼠造血系统辐射损伤与修复的比较观察

陈孟毅 林帅, 吴丽贤 刘冰 李程程 李德冠 孟爱民

1中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021；2福建医科大学药学院，福建省天然药物药理学重点实验室，福州 350108；3中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津300192

目前，肿瘤的发病率持续上升[1-2]，治疗方法包括手术治疗、化疗、放疗[3]和靶向治疗[4]。临床上大部分肿瘤患者需要接受放疗[5]。放疗在对癌细胞进行杀伤的同时也对正常细胞造成了辐射损伤。辐射损伤后造血及免疫功能恢复迟缓是放疗最严重的不良反应之一[6]。造血系统对辐射高度敏感[7]，儿童和老人的造血系统较青壮年对辐射更加敏感[8-9]。本研究观察辐射对不同年龄小鼠（幼年鼠、青年鼠、老年鼠）造血系统的损伤和恢复的影响，探讨幼年鼠、老年鼠受照后造血系统的反应性与青年鼠的差异，以期为儿童和老人的辐射防护提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

137Cs γ射线照射源（GAMMA-CELL40）为加拿大原子能有限公司产品，剂量率为0.873 Gy/min；流式细胞仪（C6）为美国BD公司产品；全自动血液分析仪（MEK-7222K）为日本光电工业株式会社产品。Biotin-B220、Biotin-Gr-1、Biotin-Ter119、Biotin-CD4、Biotin-CD8a、Biotin-CD11b、Sca-1-PE、c-kit-APC购自美国eBioscience 公司，Streptavidin-Percp购自美国Biolegend公司。

1.2 实验动物

幼年（3周龄，10 g左右）、青年（8周龄，22 g左右）、老年（14月龄，30 g左右）雄性C57BL/6小鼠（无特定病原体级）各60只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司（合格证号：SCXK（京）2014-0004），饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物房屏障环境内。

1.3 动物分组

将实验小鼠按照随机区组法分为对照组、2 Gy照射组、4 Gy照射组，每组各20只。其中，照射组小鼠给予一次性全身137Cs γ射线照射，吸收剂量为2 Gy、4 Gy，照射剂量率为0.873 Gy/min，对照组给予假照射（即不照射）。分别于照射后第3、7、14、28天取材。实验过程中，所有动物在同等条件下饲养，自由饮水和摄食。

1.4 外周血计数

取0.5 mL外周血用乙二胺四乙酸-K3抗凝，用全自动血细胞计数仪测定WBC、RBC和血小板（blood platelet，PLT）计数。

1.5 单侧股骨骨髓有核细胞分离计数

无菌分离小鼠单侧股骨，用含2%胎牛血清的PBS将骨髓细胞冲出并进行细胞计数。

1.6 骨髓细胞分型检测

取106个骨髓细胞，加入Biotin-B220、Biotin-Gr-1、Biotin-Ter119、Biotin-CD4、Biotin-CD8a、Biotin-CD11b抗体与PBS的混合液4 μL，4℃避光孵育30 min，洗涤1次后弃上清；加入Sca-1-PE、c-kit-APC、Streptavidin-Percp抗体与PBS的混合液4 μL，室温避光染色20 min，加入1 mL含2%胎牛血清的PBS，1000 r/min离心5 min（离心半径为35 cm）后弃上清，加入300 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）（Lin−c-kit+Sca1+）、造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）（Lin−c-kit+Sca1−）占小鼠体内总细胞的百分比。

单侧股骨HSC绝对百分比=（照射组HSC百分比×单侧股骨细胞计数）/（同组对照组HSC百分比×单侧股骨细胞计数）×100%；

单侧股骨HPC绝对百分比=（照射组HPC百分比×单侧股骨细胞计数）/（同组对照组HPC百分比×单侧股骨细胞计数）×100%

1.7 粒单系造血祖细胞集落形成单位（colony forming unit-granulocyte macrophage，CFUGM）的测定

将同组小鼠骨髓细胞悬液混合计数，取1×104个（对照组）、2×104个（2 Gy照射组）、4×104个（4 Gy照射组）骨髓细胞至2 mL甲基纤维素培养基（M3534）中，振荡器充分混匀，用2 mL注射器连接16#平头注射器针头，吸取细胞混悬液，加入12孔板，每组6个复孔，每孔0.5 mL。轻摇培养板，使培养基均匀分布。置入37℃、5% CO2培养箱中培养7 d后，在倒置显微镜下采用低倍镜观察集落形成情况，细胞数≥50个为1个集落。

CFU-GM绝对百分比=照射组阳性集落数/同组对照组阳性集落数×100%

1.8 统计学方法

采用Prism5软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，在方差齐的条件下，组间两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辐射对小鼠外周血计数的影响

不同剂量照射后，不同年龄小鼠的损伤程度不同。由表1可知，3组小鼠的WBC均在第3天降至最低值，其中4 Gy照射组降低程度重于同组2 Gy照射组，且呈剂量依赖性。第3天时，幼年鼠2 Gy、4 Gy照射组WBC分别下降至同组对照组的34.8%、19.6%；青年鼠2 Gy、4 Gy照射组下降至同组对照组的43.8%、20.0%；老年鼠2 Gy、4 Gy照射组下降至同组对照组的19.0%、8.4%。之后逐渐恢复，在第28天时3组小鼠的WBC基本上恢复至正常水平。由表2可知，幼年鼠2 Gy照射组RBC在第3天时低于同组对照组，4 Gy照射组在第3、14天时RBC显著低于同组对照组，第14天时低于2 Gy照射组；老年鼠2 Gy照射组RBC在第7、14天时低于同组对照组，4 Gy照射组在第3、7、14天时低于同组对照组，且在第7、14天时低于2 Gy照射组。第28天时3组小鼠RBC均恢复至接近对照组水平。由表3可知，幼年鼠2 Gy、4 Gy照射组PLT在第14、28天时低于同组对照组；而青年鼠照射组和老年鼠照射组与同组对照组相比无明显变化。

表1 辐射对不同年龄小鼠外周血白细胞计数的影响[（±s）× 109/L）]（n=5）Table 1 Effects of radiation on white blood cell count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×109/L)](n=5)

表1 辐射对不同年龄小鼠外周血白细胞计数的影响[（±s）× 109/L）]（n=5）Table 1 Effects of radiation on white blood cell count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×109/L)](n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，2.717≤t≤24.590，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，2.822≤t≤7.431，均P<0.05。

组别照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组4.60±0.957.15±0.756.50±0.304.55±0.65 2 Gy照射组1.58±0.13a3.72±0.65a4.30±0.14a3.90±0.25 4 Gy照射组0.94±0.34a, b2.30±0.49a, b2.16±0.78a, b4.42±0.45青年鼠（8周龄）对照组4.50±0.106.50±0.403.60±0.103.00±0.20 2 Gy照射组1.97±0.87a3.52±0.436.45±1.17a6.20±0.69a 4 Gy照射组0.93±0.13a1.72±0.31a, b2.96±0.39b3.64±0.65b老年鼠（14月龄）对照组8.85±0.118.05±0.559.65±0.657.75±1.45 2 Gy照射组1.68±0.17a3.90±0.61a3.90±0.61a4.64±1.02a 4 Gy照射组0.74±0.19a, b3.10±0.72a, b3.10±0.72a5.00±1.73

表2 辐射对不同年龄小鼠外周血红细胞计数的影响[（±s）× 1012/L）]（n=5）Table 2 Effects of radiation on red blood cell count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×1012/L)](n=5)

表2 辐射对不同年龄小鼠外周血红细胞计数的影响[（±s）× 1012/L）]（n=5）Table 2 Effects of radiation on red blood cell count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×1012/L)](n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，3.064≤t≤12.000，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，3.282≤t≤7.454，均P<0.05。

组别照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组8.36±0.478.25±0.278.94±0.079.06±0.21 2 Gy照射组7.38±0.37a8.23±0.208.93±0.109.03±0.19 4 Gy照射组7.01±0.13a7.95±0.387.94±0.22a, b8.35±0.91青年鼠（8周龄）对照组8.36±0.478.71±1.259.14±0.029.80±0.01 2 Gy照射组7.70±3.387.94±0.369.17±0.1810.42±0.37 4 Gy照射组8.04±0.517.75±0.388.32±0.22a, b9.70±0.24b老年鼠（14月龄）对照组8.55±0.119.77±0.238.69±0.108.53±0.34 2 Gy照射组8.22±0.398.09±0.17a8.22±0.429.09±0.58 4 Gy照射组7.96±0.347.24±0.21a, b7.21±0.28a, b8.40±0.57

表3 辐射对不同年龄小鼠外周血血小板计数的影响[（±s）×109/L）]（n=5）Table 3 Effects of radiation on platelet count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×109/L)](n=5)

表3 辐射对不同年龄小鼠外周血血小板计数的影响[（±s）×109/L）]（n=5）Table 3 Effects of radiation on platelet count in peripheral blood in mice of different ages [(±s)×109/L)](n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，3.125≤t≤7.198，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，2.457≤t≤4.669，均P<0.05。

照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组477.00±31.76455.00±60.00516.00±26.00505.50±13.50 2 Gy照射组483.80±41.50383.80±35.31346.25±22.07a359.25±39.38a 4 Gy照射组547.40±136.63258.20±95.96b311.60±32.77a368.60±51.66a青年鼠（8周龄）对照组377.79±29.79292.50±25.50512.50±20.50447.50±3.50 2 Gy照射组590.67±261.81a375.60±64.26381.75±57.60a474.80±81.93 4 Gy照射组435.50±63.26292.20±47.07287.20±63.13547.60±71.37老年鼠（14月龄）对照组641.50±18.50709.50±111.50822.00±47.00692.00±112.00 2 Gy照射组702.80±195.68759.40±143.19868.00±176.50750.60±154.56 4 Gy照射组664.80±48.55593.40±73.791 258.20±66.05a, b744.60±262.76组别

2 Gy、4 Gy照射后，小鼠外周血RBC和PLT未发生明显改变，WBC降低较为明显，且幼年鼠和老年鼠WBC损伤较青年鼠严重。幼年鼠2 Gy照射组WBC在第3天时为对照组的34.8%，第7天时恢复至对照组的52%，4 Gy照射组WBC在第3天时为对照组的19.6%，第7天时恢复至对照组的32%；老年鼠2 Gy照射组WBC在第3天时为对照组的19%，第7天时恢复至对照组的48%，4 Gy照射组WBC在第3天时为对照组的8.4%，第7天时恢复至对照组的38.5%，这表明老年鼠在受到辐射损伤后WBC的恢复能力优于幼年鼠。

2.2 辐射对小鼠单侧股骨骨髓有核细胞计数的影响

小鼠的单侧股骨骨髓有核细胞计数可以在一定程度上反映骨髓的造血能力。由表4可知，受照后，3组小鼠的单侧股骨骨髓有核细胞计数均在第3天下降至最低值，4 Gy照射组下降程度高于2 Gy照射组，呈剂量依赖性。第3天时，幼年鼠2 Gy照射组和4 Gy照射组分别下降至同组对照组的44.5%、14.2%，青年鼠2 Gy照射组和4 Gy照射组分别下降至同组对照组的74.8%、25.4%，老年鼠2 Gy照射组和4 Gy照射组分别下降至同组对照组的53.2%、35.1%，这表明幼年鼠和老年鼠的损伤程度重于青年鼠。第28天时，青年鼠和老年鼠的单侧股骨骨髓有核细胞计数已恢复至接近同组对照组水平，而幼年鼠2 Gy照射组和4 Gy照射组在第28天时未恢复正常，这提示在相同剂量的辐射照射下，幼年鼠的损伤程度较重、恢复较慢。

表4 辐射对不同年龄小鼠单侧股骨骨髓有核细胞计数的 影响[（±s）×106/L）]（n=5）Table 4 Effects of radiation on the count of unilateral femur bone marrow nucleated cell in mice of different ages [(±s)×106/L)](n=5)

表4 辐射对不同年龄小鼠单侧股骨骨髓有核细胞计数的 影响[（±s）×106/L）]（n=5）Table 4 Effects of radiation on the count of unilateral femur bone marrow nucleated cell in mice of different ages [(±s)×106/L)](n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，2.532≤t≤16.260，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，2.532≤t≤26.200，均P<0.05。

组别照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组20.30±2.0524.60±5.4020.40±0.0026.00±0.40 2 Gy照射组9.04±1.06a22.48±4.2121.10±6.6118.20±3.30 4 Gy照射组2.88±0.47a, b15.84±2.5415.28±2.5216.08±2.90a青年鼠（8周龄）对照组31.40±3.0031.60±0.0035.20±10.0035.40±9.40 2 Gy照射组23.47±0.50a33.28±5.3028.70±3.0942.40±4.74 4 Gy照射组8.00±0.75a, b26.80±2.3721.12±2.53b45.12±7.10老年鼠（14月龄）对照组36.50±14.5034.80±8.4044.60±2.2039.20±3.60 2 Gy照射组19.40±3.6745.60±2.4733.00±3.56a44.40±6.28 4 Gy照射组12.80±2.71a35.52±12.2023.84±4.85a, b40.08±2.56

2.3 辐射对小鼠骨髓HSC和HPC的影响

小鼠骨髓细胞中的HSC和HPC数量的变化与造血功能密切相关。由表5可知，受照后，幼年鼠照射组第3天时HSC显著下降，4 Gy照射组的下降程度高于2 Gy照射组，且呈剂量依赖性，2 Gy照射组在第28天时恢复至正常水平，4 Gy照射组恢复较慢，第28天时HSC仍低于2 Gy照射组，仅恢复至同组对照组的40.9%。青年鼠照射组第3天和第7天时HSC较低，2 Gy照射组在第14天恢复正常水平，4 Gy照射组在第28天恢复正常水平。老年鼠照射组第7天时HSC显著低于同组对照组，但第14天时已逐渐恢复至正常水平。

由图1和表5可见，照射组小鼠在第3天时HSC绝对百分比几乎为最低，之后逐渐恢复，第28天时，2 Gy照射的3组小鼠的HSC基本恢复至正常水平，而4 Gy照射的仅青年鼠和老年鼠的HSC恢复至正常水平，幼年鼠HSC绝对百分比低于50%，显著低于青年鼠和老年鼠，这表明幼年鼠照射后损伤较重，恢复较慢。

表5 辐射对小鼠骨髓细胞中造血干细胞百分比的影响（±s） （n=5）Table 5 Effects of radiation on hematopoietic stem cells in mice bone marrow cells (±s) (n=5)

表5 辐射对小鼠骨髓细胞中造血干细胞百分比的影响（±s） （n=5）Table 5 Effects of radiation on hematopoietic stem cells in mice bone marrow cells (±s) (n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，4.723≤t≤25.660，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，4.650≤t≤7.399，均P<0.05。

组别照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组0.42±0.030.35±0.050.18±0.000.22±0.05 2 Gy照射组0.15±0.04a0.25±0.03a0.06±0.03a0.31±0.09 4 Gy照射组0.01±0.00a, b0.16±0.02a, b0.13±0.050.09±0.04a, b青年鼠（8周龄）对照组0.27±0.050.28±0.040.26±0.040.24±0.00 2 Gy照射组0.07±0.03a0.02±0.01a0.24±0.060.24±0.03 4 Gy照射组0.03±0.01b0.04±0.01a0.12±0.06a0.24±0.04老年鼠（14月龄）对照组0.20±0.030.30±0.020.17±0.020.21±0.04 2 Gy照射组0.14±0.040.11±0.02b0.18±0.160.17±0.07 4 Gy照射组0.11±0.030.12±0.04a0.22±0.050.32±0.11

图1 照射后小鼠骨髓细胞中HSC绝对百分比的变化 图中，A：2 Gy照射；B：4 Gy照射。HSC：造血干细胞。b：与青年鼠照射组相比，3.280≤t≤9.684，均P<0.05；a：与老年鼠照射组相比，2.639≤t≤6.293，均P<0.05。Fig.1 Changes of hematopoietic stem cells absolute percentage in mice bone marrow cells after irradiation

由表6可知，照射组小鼠在第3天时HPC百分比较低，4 Gy照射组下降程度高于2 Gy照射组，且呈剂量依赖性。之后逐渐恢复，第28天时3组小鼠HPC均接近正常水平。由图2和表6可见，受照后，3组小鼠HPC绝对百分比在第3天下降至最低值，青年鼠和老年鼠在第28天时已恢复至接近同组对照组水平，幼年鼠恢复较慢，仅恢复至同组对照组的50%左右。

由此可见，相比于青年鼠和老年鼠，幼年鼠的造血系统对辐射损伤更为敏感，受照后损伤更严重，恢复较差。

2.4 辐射对小鼠骨髓细胞增殖功能的影响

由图3中A可见，幼年鼠对照组的CFU-GM阳性集落数显著低于青年鼠对照组，老年鼠对照组CFU-GM阳性集落数显著高于幼年鼠和青年鼠对照组。图3中B和C显示，受照后，青年鼠CFU-GM绝对百分比在第3天下降至最低值，4 Gy照射组的下降程度高于2 Gy照射组，且呈剂量依赖性，在第28天时恢复至正常水平。与青年鼠相比，幼年鼠照射组和老年鼠照射组CFU-GM绝对百分比在第28天时显著低于青年鼠，未恢复至正常水平。由此可见，与青年鼠相比，照射后，幼年鼠和老年鼠骨髓细胞的增殖能力减弱，损伤后恢复能力减慢。

表6 辐射对小鼠骨髓细胞中造血祖细胞百分比的影响（±s） （n=5）Table 6 Effects of radiation on hematopoietic progenitor cells in mice bone marrow cells (±s) (n=5)

表6 辐射对小鼠骨髓细胞中造血祖细胞百分比的影响（±s） （n=5）Table 6 Effects of radiation on hematopoietic progenitor cells in mice bone marrow cells (±s) (n=5)

注：表中，a：与同组对照组相比，2.685≤t≤19.100，均P<0.05；b：与同组2 Gy照射组相比，2.861≤t≤6.268，均P<0.05。

组别照射后时间第3天第7天第14天第28天幼年鼠（3周龄）对照组0.22±0.080.22±0.010.10±0.020.27±0.03 2 Gy照射组0.13±0.08a0.17±0.02a0.06±0.020.27±0.01 4 Gy照射组0.02±0.01a0.14±0.02a0.05±0.020.25±0.06青年鼠（8周龄）对照组0.32±0.130.23±0.040.24±0.040.26±0.04 2 Gy照射组0.02±0.010.03±0.010.15±0.010.25±0.02 4 Gy照射组0.01±0.010.02±0.020.11±0.010.29±0.05老年鼠（14月龄）对照组1.26±0.090.16±0.020.24±0.020.32±0.01 2 Gy照射组0.53±0.10a0.11±0.020.25±0.110.36±0.06 4 Gy照射组0.18±0.04a, b0.21±0.07b0.20±0.000.32±0.11

图2 照射后小鼠骨髓细胞中HPC绝对百分比的变化 图中，A：2 Gy照射；B：4 Gy照射。a：与青年鼠照射组相比，2.473≤t≤5.598，均P<0.05。b：与老年鼠照射组相比，2.766≤t≤5.539，均P<0.05。Fig.2 Changes of hematopoietic progenitor cells absolute percentage in mice bone marrow cells after irradiation

图3 照射后小鼠骨髓细胞增殖功能的变化 图中，A：不同年龄的健康对照小鼠CFU-GM阳性集落数；B：2 Gy照射对小鼠骨髓细胞增殖功能的影响；C：4 Gy照射对小鼠骨髓细胞增殖功能的影响。CFU-GM：粒单核造血祖细胞集落形成单位。a：与青年鼠照射组相比，2.302≤t≤5.604，均P<0.05；b：与老年鼠照射组相比，3.019≤t≤5.194，均P<0.05。Fig.3 Changes of proliferation function of mice bone marrow cells after irradiation

3 讨论

恶性肿瘤是一类与衰老有关的疾病[10-11]，近年来其发病率逐年增加[12]。恶性肿瘤的发病多在50岁以后，以中老年人为常见。老年人肿瘤发生的危险程度是中青年人的11倍[13]。理化因素、生物因素等在儿童恶性肿瘤的发病中起着重要作用，美国儿童恶性肿瘤的发病率从1975年的11.5/10万上升至2002年的14.6/10万[14]。放疗在对癌细胞进行杀伤的同时也对正常细胞造成辐射损伤，损伤后造血系统功能恢复迟缓[15]，儿童和老年人的造血系统较青壮年更加敏感，临床上主要通过调整辐射剂量来减轻对儿童和老年人的损伤[16]。

本研究结果表明，受照后，不同年龄的3组小鼠的多数指标在前3天出现急性抑制现象，且呈剂量依赖性。与青年鼠相比，幼年鼠WBC损伤更重且恢复较差，提示受照后幼年鼠在固有免疫方面比青年鼠敏感。幼年鼠单侧股骨骨髓有核细胞计数下降较为明显，损伤较重且恢复较慢，4 Gy照射组HSC绝对百分比在第28天恢复至50%，2 Gy和4 Gy照射组HPC绝对百分比在第28天恢复至50%左右，幼年鼠CFU-GM预后较差，提示受照后幼年鼠造血系统比青年鼠更敏感，功能尚未发育健全。老年鼠WBC损伤更重且预后较差，提示受照后老年鼠在固有免疫方面较青年鼠敏感。老年鼠CFU-GM预后较差，提示受照后老年鼠造血系统比青年鼠更敏感。

总之，与青年鼠相比，受照后幼年鼠外周血RBC和PLT未发生明显改变，WBC、单侧股骨骨髓有核细胞计数、HSC百分比、HPC百分比、CFU-GM绝对百分比等减少较为严重，恢复较慢甚至不能完全恢复；老年鼠WBC比青年鼠和幼年鼠损伤更为严重，单侧股骨骨髓有核细胞计数、HSC百分比、HPC百分比在第28天时基本恢复正常，而CFU-GM绝对百分比低于青年鼠，提示老年鼠骨髓细胞的增殖能力减弱。本研究结果提示，根据不同年龄小鼠辐射损伤的特点应该给予不同的治疗手段，如幼年鼠对辐射较为敏感，照射后易受损伤，故幼年鼠在照射后需及时监测受损情况，若损伤较重需要适当降低照射剂量，若恢复较慢可以适当给予促进恢复的治疗；老年鼠则需注意功能恢复情况。

临床上，辐射损伤后造血及免疫功能恢复迟缓是导致急性辐射损伤综合征患者死亡的主要原因。辐射剂量越大，造血及免疫功能受损越严重[17]。此前，针对不同年龄的放疗患者，调整辐射剂量可能是更需考虑的问题，但放疗对不同年龄患者造血系统损伤的差异需要进行系统研究。我们为了比较年龄差异对辐射导致造血系统损伤修复作用的影响，选用了2 Gy和4 Gy分别观察不同年龄的辐射损伤模型小鼠对辐射损伤反应性的差异，为临床照射剂量的选择和临床监护提供了实验基础。