高效液相色谱-质谱法检测酱油中5-羟甲基糠醛
2019-12-14刘超景赞黄志勇
刘超，景赞，黄志勇
（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）
酱油，作为一种富有营养和特殊香味的调味品，是目前最常见的家庭调料。酱油在制作过程中会发生美拉德（Maillard）反应，即还原糖与氨基酸反应，烯醇式Amadori重排产物在1，2 位置烯醇化并消去C3 上的羟基，加H2O生成3-脱氧己糖酮，然后脱水生成5-羟甲基糠醛类风味成分[1-5]。
5-羟甲基糠醛对眼、黏膜、皮肤有刺激性，过量食用会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害[6]。目前对酱油中5-羟甲基糠醛含量的检测主要有液相色谱法[7]、紫外分光光度法[8]等，这些方法因灵敏度低、易出现假阳性等原因，很难满足酱油中5-羟甲基糠醛的准确测定。本试验使用了液相色谱-三重四级杆质谱法检测酱油中5-羟甲基糠醛，具有灵敏度高、特异性强等特点，在国内尚属首次。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇，99.9%，HPLC/ACS 级，北京市百灵威科技有限公司；甲酸纯度≥88%，HPLC 级，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸乙酯，99.9%，HPLC/ACS 级，J&K SCIENTIFIC LTD；5-羟甲基糠醛，99.0%，化学试剂，Sigma 公司，批号C16308402。
1.2 仪器与设备
1.3 色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5 C18，（3.9 mm×150 mm，5/um)；流动相A：甲醇；流动相B：0.05%甲酸；流速：0.4 mL/min；进样体积：10 μL。梯度洗脱程序如表1 所示。
1.4 质谱条件
高效液相色谱串联质谱仪：DGU-20A-API3200。质谱参数：采用ESI 源正离子扫描模式，离子源参数见表2。扫描模式：多反应监测（MRM），监测参数如表3 所示。
表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution procedure
表2 质谱条件Table 2 Mass spectrum condition
表3 多反应监测参数Table 3 Multi-reaction monitoring parameters
1.5 标准曲线的绘制
1.5.1 标准储备溶液的制备
精密称取10 mg 的5-羟甲基糠醛至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配制成1 mg/mL 的标准溶液，在4 ℃下避光储存。
1.5.2 标准中间溶液的制备
吸取1 mL 储备液至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配成100 μg/mL 的标准溶液备用。
1.5.3 基质标准工作溶液的制备
称取2 g 阴性样品于塑料离心管中，加入0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.25 mL 标准液，加入10 mL 乙酸乙酯，以180 r/min 振荡10 min，超声提取10 min（功率700 W），摇匀。以4 000 r/min 离心5 min，取上清液至25 mL容量瓶中，按上述方法再提取1 次，上清液转移至同一25 mL 容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。将阳离子交换柱连接至固相萃取装置，依次用3 mL 甲醇和3 mL水活化，移取5 mL 样液至此阳离子交换柱中，流速控制在1 mL/min，用5 mL 水淋洗，抽干，用5%氨化甲醇洗脱，流速控制在1 mL/min，收集洗脱液。洗脱液经40 ℃氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，配成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4、5 μg/mL 的基质标准曲线。
引言:当前,经济生活水平的提高,人们开始更注重身体保健,所以通过定期体检尽早发现疾病并加以治疗[1]。采血作为体检中的项目之一,体检人员基于对体检认知的不足以及采血后按压手法的不当,采血后皮下血肿问题明显,造成体检人员身体、心理一定程度伤害,还会导致医疗纠纷问题[2]。护理干预工作的实施可以降低体检人员采血期间皮下血肿问题,利于提高体检人员的满意度[3]。基于此,本文就我院体检中心160例体检人员作为实验对象,总结护理干预价值。
1.6 样品制备
1.6.1 提取
称取2 g 酱油样品于50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，以180 r/min 振荡10 min，超声提取10 min（功率700 W），摇匀。以4 000 r/min 离心5 min，取上清液至25 mL 容量瓶中，按上述方法再提取1 次，上清液转移至同一25 mL 容量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，待净化。
1.6.2 净化
将阳离子交换柱连接至固相萃取装置，依次用3 mL甲醇和3 mL 水活化，移取5 mL 样液至此阳离子交换柱中，流速控制在1 mL/min，用5 mL 水淋洗，抽干，用5%氨化甲醇洗脱，流速控制在1 mL/min，收集洗脱液。洗脱液经40 ℃氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，过0.22 μm微孔滤膜，滤液供上机分析。
1.7 检出限与定量限
称取2 g 阴性样品按照1.6 的方法制备700 W，摇匀。以4 000 r/min 离心5 min，取上清液至空白溶液。用空白样品溶液将标准工作溶液稀释至产生3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比（S/N）。根据色谱图得信噪比，按S/N=3：1 和S/N=10：1 计算检出限和定量限。
1.8 方法的准确性
低浓度加标回收水平：称取2 g 阴性样品于50 mL塑料离心管中，加入一定量标准中间溶液，按1.6 操作，配置成0.125 mg/kg 的质控样品。
中浓度加标回收水平：称取2 g 阴性样品于50 mL塑料离心管中，加入一定量标准中间溶液，按1.6 操作，配置成0.50 mg/kg 的质控样品。
高浓度加标回收水平：称取2 g 阴性样品于50 mL塑料离心管中，加入一定量标准中间溶液，按1.6 操作，配置成2.0 mg/kg 的质控样品。
1.9 精密度
称取2 g 阴性样品于50 mL 塑料离心管中，加入0.0125 mL 标准中间溶液，按1.6 操作，连续进样6 针，计算相对标准偏差RSD，以确定仪器精密度。
1.10 方法的重复性
取浓度为0.25、0.5、1.0 mg/kg 的质控样品，各3 份，经1.6 处理后上机分析，测得峰面积，代入随行基质标准曲线，计算浓度及RSD，即得重复性结果，以确定方法重复性。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
图1 5-羟甲基糠醛的标准曲线Fig.1 Standard curve of 5-hydroxymethylfurfural
图1 为5-羟甲基糠醛的标准曲线，从图1 可以看出，5-羟甲基糠醛在0～5 μg/mL 的浓度范围内R2=0.999 7＞0.99，表明5-羟甲基糠醛在上述范围线性良好，故选取0～5 μg/mL 为试验的线性范围。
2.2 检出限和定量限
由图2～4 可以看出，选择m/z127.0 为5-羟甲基糠醛离子，选择碎片离子中响应值较高的3 个碎片离子m/z109.4、81.3 和53.3 作为定性和定量离子，此方法可有效避免假阳性。
图2 5-羟甲基糠醛一级质谱图Fig.2 MS spectra of 5-hydroxymethylfurfural
图3 5-羟甲基糠醛二级质谱图Fig.3 MS2 spectra of 5-hydroxymethylfurfural
图4 5-羟甲基糠醛对照品色谱图Fig.4 Chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural
2.3 方法的准确性
采用空白样品加标回收法测定该方法的准确性[9-10]。由表4 可以看出，5-羟甲基糠醛在高、中、低三个水平的回收率为81.4%～93.3%。低浓度回收率略低，且回收率随着浓度的增大而升高，在不同浓度下的回收率均满足要求。
表4 不同浓度下的5-羟甲基糠醛回收率（n=3）Table 4 Recoveries of 5-hydroxymethylfurfural at different concentration levels（n=3）
2.4 方法的重复性
表5 不同浓度下5-羟甲基糠醛的重复性（n=3）Table 5 Repeatability of 5-hydroxymethylfurfural at different concentration levels（n=3）
如表5 所示，在不同浓度下该方法重复性RSD均小于5%，表明该方法在低、中、高三水平下重复性良好。
2.5 精密度
5-羟甲基糠醛精密度测量结果为0.535 0、0.512 5、0.540 0、0.520 0、0.527 5、0.5075，RSD＜2.43%，这表明仪器精密度良好，在此浓度下可取得良好精密度。
3 结论
试验建立了液相色谱-串联质谱检测酱油中5-羟甲基糠醛的方法，并考察了其方法学指标。结果显示，该方法经乙酸乙酯提取、强阳离子固相萃取柱净化、高效液相色谱-串联质谱法检测，实现了酱油中5-羟甲基糠醛的快速检测。该方法检出限为0.60 mg/kg，加标浓度在0.125、0.50 和2.0 mg/kg 水平下的平均回收率为81.4%～93.3%；该水平下重复性RSD＜5%；精密度RSD＜3%。该方法具有操作简单、科学合理、定性定量准确等特点，适用于酱油中5-羟甲基糠醛的测定。
