富血小板血浆对MRSA的体外抑菌实验研究

刘泉体 高海明 兰 婷 吴佳奇

西南医科大学附属中医医院创伤外科，四川省泸州市 646000

富血小板血浆是血液经过离心、分离而得到的血小板高度浓缩的血液制品，通常认为其血小板含量为正常全血的5倍以上[1]。而富血小板凝胶是富血小板血浆中血小板激活的产物，通常由凝血酶、钙离子介导激活。由于其富含多种生长因子，临床上将其应用于创面及软组织的修复[2]。近年来，随着人们对其研究的深入，发现PRP有着一定的抗菌效应，涉及到的细菌包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌[3]、粪肠球菌[4]等。近年来甚至有学者表示其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)也有抗菌效应[5-6]。由于MRSA作为多重耐药细菌，其高致病性及高毒力，使得其造成的伤口感染易迁移不愈及反复发作，治疗困难。而关于PRP抗菌效应的研究受限于多种因素，其抗菌谱目前尚无统一结论，为此，本研究将通过体外实验观察健康志愿者全血提取的PRP及其激活产物PRG对MRSA是否有抗菌效应，为PRP的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 MRSA临床菌株由西南医科大学病原微生物实验室提供(来源于1例慢性骨髓炎患者)。

1.2 材料及设备 一次性真空采血管(10ml、2ml，蓝管)、采血针、一次性注射器(江苏宇力医疗)、全自动血细胞分析仪(希森美康)、葡萄糖酸钙注射液(四川美大康华康)、凝血酶冻干粉(湖南一格)、营养肉汤培养基、MH琼脂培养基、哥伦比亚血琼脂平板(杭州微生物)、分光光度仪、比色皿(上海元析)、电子天平(梅特勒—托利多)、一次性培养皿(90mm)、牛津杯(上海兢翀)、硫酸庆大霉素注射液(西南药业)、立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗)，隔水式恒温培养箱(上海齐欣)、电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣)、低速离心机(中佳 SC-2546)、气浴恒温振荡器(金坛市瑞华仪器)、生物安全柜(海尔)等。

1.3 菌株的活化、增菌 将冻存的MRSA临床菌株取1接种环划线法接种至血琼脂平板，37℃恒温培养箱培养24h。配置100ml营养肉汤培养基，高温蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。取2支15ml离心管，各加入10ml已冷却的上述营养肉汤，将血培养皿上形态规则的菌落1接种环接种至其中1支离心管，2只离心管均放入摇床，150rpm，37℃，16h后取出。

1.4 PRP的制备 采集6名健康志愿者(3男，3女，平均年龄26岁)，志愿者无心脑血管等基础疾病，实验前3个月内无感染性疾患、未服用过抗生素、抗凝药物或免疫抑制药物。一次性10ml、2ml真空采血管采集每名志愿者肘部静脉血，2ml采血管直接血细胞分析仪计数血小板，10ml采血管使用低速离心机以300×g离心力(1 410rpm)，离心10min，以注射器抽取全部上层血清至红细胞层下约3mm转移至另一真空离心管(不含任何药物)，再次以700×g离心力(2 150rpm),离心10min，抽取约3/4上层血清，余下约1ml，反复摇匀即为PRP，取200μl血细胞分析仪计数血小板。余下PRP于3h内进行实验。

1.5 庆大霉素溶液、葡萄糖酸钙—凝血酶溶液制备 取硫酸庆大霉素注射液(40 000U/ml)用灭菌纯水梯度稀释法稀释至40U/ml备用。取10%葡萄糖酸钙注射液2ml加入200U凝血酶冻干粉中，临用前配置。

1.6 打孔法抑菌实验 配置MH琼脂培养基270ml，分装至3瓶100ml容量瓶中，每瓶装90ml，高温蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，放置于室温下逐渐冷却。将增菌完毕的菌悬液在摇菌16h取出，以增菌用营养肉汤为对照，分光光度计测定原菌液OD600值，通过营养肉汤倍比稀释至OD值为0.5左右。取稀释后的该菌悬液以灭菌纯水梯度稀释100倍，取10ml分别倒入冷却至45℃左右的MH琼脂培养基中摇匀，再另取该菌悬液1ml以灭菌纯水梯度稀释法稀释至10-6、10-7、10-8数量级，各取100μl于营养琼脂培养基中涂板计数，每个数量级涂板2个，取平均数。取20个一次性培养皿，每个培养皿均分为A、B、C、D四个区域，每个区域即为一组，区域中心放置牛津杯(内径为6mm，外径为8mm)，将配置好的带菌液的培养基每15ml倾注至一次性培养皿中制备带菌平板共20个。放置5min后取出牛津杯，此时MH琼脂培养基已凝固，四个区域中心各1个直径约8mm孔，分别于上述ABCD四个区域各孔中加入50μl硫酸庆大霉素溶液、PRP、PRP、灭菌纯水。于C区域中加入5μl葡萄糖酸钙—凝血酶溶液。将培养皿放入37℃恒温培养箱中，12h取出观察结果。

1.7 结果判定 使用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。抑菌圈直径(mm)=所测得的直径平均数-8mm。

1.8 统计学方法 使用Ecxel汇总数据，SPSS18.0统计软件行统计分析，P值<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌接种于血琼脂培养基培养24h后取出可见金黄色菌落形成，接种MRSA的离心管经增菌培养后16h后可见试管内溶液浑浊，而仅含有营养肉汤培养基的离心管中仍清亮。提示MRSA细菌生长良好，以营养肉汤为对照，测得原菌悬液OD值为1.375。经过倍比稀释后测得细菌悬液OD值为0.534。倍比稀释后的菌悬液再经梯度稀释后涂板测得细菌浓度为1.76×109CFU/ml，故经过生理盐水稀释100倍后再倒入MH琼脂培养基中的细菌浓度为1.76×106CFU/ml。

2.2 6名健康志愿者全血中所含血小板计数为(161±19.2)×109/L，经2次离心法手工制备的PRP中血小板值为(876.3±73.3)×109/L，血小板富集倍数平均为5.4倍，符合PRP的制备标准。

2.3 打孔法抑菌实验中，在PRP中加入葡萄糖酸钙—凝血酶溶液后，10min内迅速凝固成块激活形成PRG，而PRP在平板中缓慢扩散并凝固。在冷却至45℃的琼脂培养基中预加菌液后使用倾注平板法，所制备的平板菌落分布均匀，重复性好。在培养12h后取出观察可见：40U/ml的庆大霉素溶液组产生明显的抑菌圈，其平均直径大小为(17.15±0.96)mm，而PRP及PRG组与灭菌纯水一致，均无抑菌圈产生。见图1。

图1 培养12h后抑菌圈产生情况

注：左上角“P”代表PRP，右上角“G”PRG，左下角“+”代表庆大霉素，右下角“-”代表灭纯水。

3 讨论

富血小板血浆的抗菌效应研究由来已久，关于其抗菌机制，目前更多的观点将其归功于高浓度的血小板及白细胞。血小板裂解后释放的抗菌肽被认为是血小板的主要抗菌机制，一些抗菌肽可以通过破坏细菌的细胞膜，抑制微生物RNA的合成、蛋白的合成或者蛋白折叠，灭活细菌毒素，激活细菌的自溶系统。血小板还能介导炎性细胞的趋化，也被认为是其抗菌的主要机制[7-8]。

而关于富血小板血浆中所含白细胞抗菌作用目前仍有争议，传统观点认为，白细胞介导细胞免疫，在机体抵御外来感染的斗争中占据主导地位，而Mariani等人[9]通过体外抗菌实验研究了含不同白细胞的PRP制剂对一些细菌的抗菌效应，得出白细胞的存在并不会增加血小板在体外抗菌效应。

对于富血小板血浆的抗菌谱，目前的研究认为PRP及PRG对包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、白色念珠菌、口腔链球菌、痤疮丙酸杆菌等可能存在抗菌效应，由于所纳入的研究众多，菌种不同、实验条件、实验方法及对象差异也较大，因此即便是对同一种细菌，不同的研究也可能得出不同的结论。如吴兵[10]以免血制备PRP与抗生素联合使用的实验中，未能发现PRP对金黄色葡萄球菌的抑制效果。杨阎峙等[11]以健康志愿者静脉血制备PRP进行体外抗菌实验，得出结论为富血小板凝胶对大肠杆菌及铜绿假单胞菌无明显抑菌作用。PRP 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌均无明显抑菌作用。而Çetinkaya等[6]研究表明PRP和PPP在体外对MRSA、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌有抑制作用。不仅如此，在一些大型的临床研究中依然存在不同的结论[12-13]。一方面目前许多的体外研究实验所采用的方法为时间—抑菌曲线法，而这种方法存在一个非常关键并且容易被忽略的问题：所有时间抑菌曲线法都需要配置反应管，在共混合物培养中，PRP会被其余加入的物质稀释，可以认为在加入反应管之前的物质是PRP，但存在于反应管内的物质由于其血小板浓度被稀释后已达不到PRP标准甚至低于全血，故此种方法得出的结论可靠性有待考量。由于MRSA多重耐药的特性，在骨科领域中，其治疗一直是许多外科医师所头疼的问题，并且近年来MRSA检出率逐渐增高，由其感染所致的骨髓炎患者，常常需要多次手术，并且存在终身不愈的风险。为了明确PRP或PRG能否对MRSA临床菌株有抗菌效果，为骨科领域中难愈性感染的治疗提供新的参考，故本实验采用定性实验设计，通过纸片扩散法原理，在不改变PRP使用浓度的情况下，观察抑菌圈的有无及大小来求证。

在本实验中，笔者选择含枸橼酸钠的蓝色盖头一次性真空采血管作为血小板的保存剂，是由于该采血管相比含乙二胺四乙二酸盐的紫色盖头管更有利于血小板的保存，并且枸橼酸盐对人体安全性更高，采血管获取方便。在实验前，查阅了骨髓炎患者MRSA的耐药情况并收集了本院相关资料，发现MRSA对于临床上常用于冲洗创口的庆大霉素耐药率相对不高，并且于实验前已将菌种送检药敏证实其对庆大霉素敏感，故本实验阳性对照组采用庆大霉素。由健康志愿者全血经过离心后血小板浓集倍数达到了目前公认PRP的标准，是一种实用、经济、安全的制备方法。制备过程中需要注意的是，初次离心后白膜层富含大量的血小板，确保吸取转移至二次离心，在二次离心后仍然可见到白膜层，移去较多的血清可以进一步提高PRP中血小板的浓度。制备后的PRP需要充分摇匀以确保血小板分布均匀，否则由于离心后大量的血小板沉淀在管底，将使测得的PRP中的血小板数量比实际偏低[14]。同时本实验采用的预加菌液倾注平板法[15]，制备的带菌平板细菌分布均匀，可以避免普通的涂布法出现细菌分布不均的情况，打孔法使得药物能够在琼脂中均匀扩散，弥补了纸片扩散法的不足，使该实验可行性及重复性得到提高，并且在条件许可下尽量选择较低的细菌浓度，以利于观察细微的变化。 在PRG组中的平板孔中加入葡萄糖酸钙—凝血酶复合物时，可以明显地看到，在10min内PRP迅速于滴加药物的位置凝聚成块形成PRG。而PRP组血小板均匀向琼脂周围扩散，于孔边缘缓慢凝固。在恒温培养箱中培养12h后，庆大霉素组产生均匀的抑菌圈，边界清晰，识别度高，平均抑菌圈直径为(17.15±0.96)mm。PRP组及PRG组同阴性对照组在本次实验中均未看到抑菌圈产生，提示健康志愿者全血所制备的PRP及其激活产物PRG对MRSA临床菌株无抗菌效应，PRP及PRG对临床上MRSA感染控制可能无益。

由于研究条件的限制，本实验仍然存在着不足：(1)由于实验所需血液样本并不多，纳入的研究对象不大，并且实验对象为健康志愿者，有别于住院患者。由于创伤、感染等多重因素刺激，患者体内的血小板水平往往较高，经过同样的方法制备的PRP其血小板水平与健康人不在同一水平。(2)本实验中观察时间选定为12h，尽管一些文献中PRP和细菌共培养24h或者48h后仍能够产生抑菌圈[16]，但一些学者通过绘制时间—抑菌曲线的研究认为PRP发挥抗菌效应有时效性，维持时间较短，并且PRP发挥的是抑菌作用而非杀菌作用，当这种抑制作用消失后，细菌又会继续生长。而本实验为定性实验设计，抑菌圈的形成需要未被抑制生长的细菌不断传代而显示，无法了解实验组周围细菌每一时间的活性变化，并且在能够产生肉眼可辨的抑菌圈情况下，选择了尽可能低的细菌浓度，但这种浓度与临床上患者伤口中细菌浓度仍有差异。(3)本实验中PRP及PRG对MRSA无抑菌效应，但临床上感染该细菌的患者通常都会使用诸如万古霉素之类的强效抗生素，在这类患者中PRP或PRG的使用是否会影响抗生素的抗感染效果不得而知。此外，体外实验仅针对体外环境，可以作为体内实验的参考，在体内是否也是如此结论，有待于进一步研究。