高效液相色谱法检测动物性产品中3种氟喹诺酮类药物残留的研究

方永卫 师永华2 郭向阳

1.双汇集团 河南漯河 462300 2.漯河市动物卫生监督所 河南漯河 462300

环丙沙星、恩诺沙星和麻保沙星均属于氟喹诺酮类抗菌药物，因其具有抗菌谱广[1]、吸收率高、组织穿透力强和价格低廉的优点，很快就被普遍应用到动物性疾病的防治中。目前国内兽用喹诺酮类药物药物的使用量已经接近500t/年[2]。

但是集约化养殖，养殖环境比较差，动物容易感染疾病，还有为寻求快速的商业回报利益，很多养殖户滥用氟喹诺酮类药物或者违禁添加抗菌药，这导致了动物性产品中氟喹诺酮类药物含量的超标。我国和世界卫生组织、欧盟、日本等国家和组织，也都已经将喹诺酮类药物列入了限制使用的兽药名单中[3]。所以，我们不仅要在源头预防，加强对养殖户的监管；同时，还要致力于研究动物性食品中氟喹诺酮类药物残留的各种检测方法，以利于相关执法人员对动物性产品抗菌药残留的检查更加方便、快速和准确，以确保人们能够食用健康安全的动物性产品。本实验尝试建立高效液相色谱法，测定动物性产品中3种氟喹诺酮类药物含量水平的方法。主要包括：(1)通过紫外线扫描，确定这三种氟喹诺酮类药物物质的吸收波长范围，然后选择适宜的吸收波长进行检测；(2)流动相和检测条件优化，包括对流动相的组成成分及比例，还有检测采用固相还是梯度洗脱及洗脱条件，进样量和流速等条件进行一一优化；(3)配制一系列不同浓度标准品工作液，按照优化好的色谱条件进行上样检测，整理实验结果，建立三种目标物的标准曲线，并确定其对应检测限；(4)采用最优提取方案，进行奶样和肉样的添加回收试验，并测定这三种氟喹诺酮类的添加回收率。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

麻保沙星药品，杭州创世纪医药科技有限公司；

环丙沙星药品，杭州创世纪医药科技有限公司；

恩诺沙星药品，杭州创世纪医药科技有限公司；

氢氧化钠，天津市德恩化学试剂有限公司；

无水硫酸钠，天津市德恩化学试剂有限公司；

乙酸，江苏强盛功能化学股份有限公司；

三乙胺，天津市德恩化学试剂有限公司；

磷酸，开封开化(集团)有限公司；

正己烷，天津市德恩化学试剂有限公司；

异丙醇，天津市德恩化学试剂有限公司；

无水乙醇，天津市德恩化学试剂有限公司；

甲醇(色谱纯)，西陇化工股份有限公司；

乙睛(色谱纯)，西陇化工股份有限公司；

纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；

注：以上无特殊标注的试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

移液枪，郑州博科仪器有限公司；

冰箱，河南新飞电器有限公司；

超声波清洗器，金坛市吉特实验仪器厂；

FA2004N电子分析天平，河北省虹宇设备有限公司；

超净工作台，苏州净化设备有限公司；

高效液相色谱仪，杭州尔首科学仪器有限公司；

紫外检测器，惠州市华高仪器设备有限公司；

电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

低速离心机，金坛市恒丰仪器制造有限公司；

高速离心机，浙江三联环保科技股份有限公司；

旋转蒸发器，上海申生科技有限公司；

微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；

氮吹仪，青岛国胜焊割设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 目标物最大吸收波长的确定

对环丙沙星溶液、恩诺沙星溶液和麻保沙星浓度均为25μg/mL的单标溶液进行扫描，麻保沙星吸收波长在298～299nm，恩诺沙星吸收波长278～180nm，环丙沙星吸收峰也在278nm左右。综合实验检测结果和干扰因素考虑，选择麻保沙星吸收波长为299nm，设置环丙沙星和恩诺沙星的吸收波长为278nm。

1.2.2 流动相和检测条件的优化

配制三种目标物的混合目标物溶液：准确称量三种标准品各3.5mg，放于同一玻璃瓶中，加入0.3mL的0.5moL/mL的氢氧化钠助溶，再加入3.2mL的色谱甲醇，配成1mg/mL的混合标准品溶液，混匀。再取其中混匀后溶液0.5mL，加入4.5mL的乙睛进行稀释成100μg/mL混合标准品溶液。配制各种可能性较大的流动相，上样检测，再根据试验现象进一步调整改进流动相组成，确定流动相和最佳检测条件，流动相A液为0.05moL/L磷酸0.5%三乙胺溶液，B液为乙睛(色谱纯)，进行洗脱。开始流动相比例，A液为90%，B液为10%；随后在18min内流动相比例变为，A液为67%，B液为33%。柱温为30℃，进样量为20μL，流速为0.8mL/min。

1.2.3 三种目标物标准曲线的绘制

对浓度分别为2.5、5、8.3、25、100μg/mL的三种目标物混合的检测溶液，上样检测。以混合目标物的浓度为横坐标，色谱峰积分面积为纵坐标，制作麻保沙星、恩诺沙星和环丙沙星三种目标物的标准曲线。麻保沙星的标准曲线回归方程为Y=178.13X-526.47，相关系数达到0.997；环丙沙星的标准曲线其回归方程为Y=177.21X-554.11，相关系数达0.9979；恩诺沙星的标准曲线，其线性回归方程为Y=202.66X-564.11，线性回归相关系数达0.998。

1.2.4 检测限的测定

对浓度分别为0.25、0.5、1.0μg/mL的混合标准液上样检测，混合检测液中麻保沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测限均为0.5μg/mL。

1.2.5 奶样的前处理方法

用移液枪量1.0mL的奶样于10mL的离心管中，加入3.0mL酸化乙腈溶液于超声5min，3 500r/min离心5min，吸取上清液置另一管中。按照以上步骤再进行处理1～2次，并与上一次清液放于同一管中。在上清液中加入3.0mL的正己烷，混合1min，3 500r/min离心5min，除去正己烷层。将下层即乙腈层转移入50mL圆底旋蒸瓶中，加进2.0mL的异丙醇，混匀，于45℃条件下减压旋蒸至近干。用流动相把残渣经多次移入到离心管中，定容至1mL左右。再加入2.0mL正己烷，涡旋混合1min，3 500r/min离心5min，除去上层，底层用0.22um的滤膜过滤，于4℃下存放。

1.2.6 肉样的前处理方法

称1.0g猪样于15.0mL离心管中，加2g无水硫酸钠，混匀。加入4.0mL酸化乙腈，2 000r/min离心1min，超声8min，2 500r/min离心5min，得上清液置25mL分液漏斗中。残渣部分再加入4.0mL的酸化乙腈，用以上处理方法在进行处理1～2次，把上清液放于25mL分液漏斗中，再加进6.0mL的正己烷，充分摇匀2min后，静置一段时间。取静置后的基层清液置于50mL圆底烧瓶中，40℃旋蒸至近干，用氮吹仪吹干。用流动相溶解瓶中的残渣，定容至1.0mL，加入1mL正己烷，13 000r/min离心8min，吸取底层的清液，经过超滤后，于4℃下存放，备检。

1.2.7 样品的添加回收试验

(1)空白样检测，从丹尼斯超市购买伊利纯牛奶和优质肉品进行检测。

(2)添加回收试验：在空白牛奶样和猪肉样品中进行一系列混合标准品溶液浓度的添加回收试验。添加浓度为5.0，10.0，25.0，50.0μg/mL，共四个浓度进行检测，计算添加回收率。

2 结果分析

2.1 奶样回收率的测定结果

对牛奶空白样检测，结果没有出现明显色谱峰。在牛奶中添加混和标准品的溶液，检测结果如图1、图2，回收率测定结果如表1。

添加目标物目标物添加水平/ug·mL-1色谱峰积分面积回收体积/mL回收浓度/ug·mL-1回收率/%麻保沙星5.0983.0960.65.08101.110.01630.6960.89.6896.825.04070.4170.923.2292.950.08675.821.051.66103.3环丙沙星5.0979.5450.65.19103.810.01557.2630.89.6296.225.03919.8390.922.7290.850.08280.63771.049.8599.7恩诺沙星5.01158.1820.65.089101.910.01914.6750.89.7897.825.04842.0410.924.0096.050.010125.11.052.74105.4

结果显示：这种牛奶提取方法的麻保沙星回收率在92.9%～103.3%之间；环丙沙星的回收率在90.8%～103.8%之间；恩诺沙星的回收率在96.0%～105.4%之间。表明这个试验确立这种牛奶提取方法可靠性良好，可以用于牛奶中这三种物质的提取检测。

2.2 肉样回收率的测定结果

对肉品的空白样检测，检测结果图谱中没有出现明显色谱峰。肉品中添加混和标准品的溶液检测结果如图3、图4，回收率测定结果表2。

添加目标物目标物添加水平/ug·mL-1色谱峰积分面积回收体积/mL回收浓度/ug·mL-1回收率/%麻保沙星5.0580.9580.84.9699.310.01748.6870.810.21102.125.04317.5570.924.4797.850.08397.0631.050.09100.1环丙沙星5.0509.7200.84.8096.010.01263.0620.88.2082.025.03721.9230.921.7186.850.07953.7901.048.0096.0恩诺沙星5.0604.8670.84.6192.210.02028.7600.810.23102.325.05157.0820.925.40101.650.09956.8731.051.91103.8

结果显示：在肉样添加回收试验中，测得麻保沙星的回收率在97.8%～104.7%之间；测得环丙沙星的回收率在82.0%～96.0%之间；恩诺沙星的回收率在101.6%～105.6%之间。表明这个试验确定的这种方法可靠性良好。

3 结论

本文成功建立了高效液相色谱法测定动物性产品3种氟喹诺酮类药物残留的方法，对实验结果进行整理综合，得出结论。

(1)麻保沙星吸收波长在298～299nm，恩诺沙星吸收波长在278～180nm，环丙沙星吸收峰在278nm左右。综合考虑，选择高效液相检测中麻保沙星吸收波长为299nm；设置环丙沙星和恩诺沙星的吸收波长均为278nm。

(2)确定相流动为A液为0.05moL/L磷酸0.5%三乙胺溶液，B液为乙睛，进行梯度洗脱，初始比例A∶B=9∶1(v/v)，在18min内流动相B液由10%上升到33%。柱温为30℃，进样量为20μL，流速为0.8mL/min进行测定，可得到最佳色谱分离图。

(3)建立的麻保沙星标准曲线，性回归方程为Y=178.13X-526.47，其相关系数为0.9970。环丙沙星线性回归方程为Y=177.21X-554.11，相关系数为0.9979。恩诺沙星线性回归方程为Y=202.66X-564.11，相关系数为0.998。表明这三种目标物的标准曲线的线性拟合效果良好。这三种物质的检测限均为0.5μg/mL。

(4)在牛奶提取方法中，三种目标物在牛奶中不同添加浓度的回收率均在97.8%～105.4%之间，肉品的添加回收率均在82.0%～105.6%之间。这表明试验建立的这种牛奶提取方法和肉品提取方法的可靠性良好，可以用于牛奶和肉品中这三种物质的提取检测。