肉制品车间关键点微生物状况研究

山东元泰生物工程有限公司 山东日照 276826

低温肉制品以其肉质细腻、携带方便、保质期长等特点，深受广大人民群众的喜爱，是居家旅行的必备佳品。但是由于其营养丰富，是微生物的天然培养基，非常适合腐败及产生毒素的微生物生长繁殖，对人们的健康造成极大的威胁[1～3]。鉴于此，控制好低温肉制品生产过程中的细节就显得尤为重要[4，5]。

本文对低温肉制品生产过程的原料、搅拌、灌装、晾晒、包装等关键环节进行了微生物分析，对其中的主要污染微生物进行了分子鉴定，期望为广大低温肉制品生产企业提供微生物防治对策的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检样品

斩拌原料、加工器具、灌装环境、灌装后产品、晾制间环境、包装前产品、包装后未二次杀菌产品、成品。以上样品均由国内一著名肉制品生产企业提供。

1.1.2 培养基

细菌计数培养基[6]、孟加拉红培养基[7]、LB培养基[8]、PDB培养基[9]。

1.1.3 设备

全自动灭菌柜、显微镜、电热恒温干燥箱、电子天平、超净工作台、生化培养箱、pH计、混合器、PCR仪、生物显微镜、高速离心机、电泳系统、凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离与培养

采用细菌计数培养基，严格按照文献[6]记录的方法，对待检样品中污染细菌的菌落总数进行计数，以及优势菌群的培养。

1.2.2 真菌的分离与培养

采用孟加拉红培养基，严格按照文献[7]记录的方法，对待检样品中污染真菌菌落总数进行计数，以及优势菌群的培养。

1.2.3 细菌形态观察

取步骤1.2.1中的优势菌种，使用革兰氏染色法进行染色，置于生物显微镜下进行观察，初步确定其种类。

1.2.4 真菌形态观察

取步骤1.2.2中的优势菌种，进行简单染色，直接置于生物显微镜下进行观察，初步确定其种类。

1.2.5 优势细菌的分子生物学鉴定

细菌总DNA的提取采用CTAB法[10]进行，16S rDNA基因扩增采用通用引物，分别为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[11]，反应体系为50μL，扩增完成后，使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，采用Genbank中的Blast程序进行相似性分析，获得菌株的准确种属。

1.2.6 优势真菌的分子生物学鉴定

真菌总DNA的提取采用文献[12]记录的方法进行，ITS基因扩增采用通用引物，序列为：ITS1-F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’反应体系为50μL[13]，扩增完成后，使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，采用Genbank中的Blast程序进行相似性分析，获得菌株的准确种属。

2 结果与分析

2.1 生产线不同部位细菌的分离与培养

按照1.2.1方法对斩拌原料、加工器具、灌装环境、灌装后产品、晾制间环境、包装前产品、包装后未二次杀菌产品、成品8个样品进行了污染细菌情况分析，并使用细菌计数培养基对其中的优势细菌进行了分离培养，按照1.2.3的方法对获得优势种类进行观察，数据见表1。

表1 生产线不同部位污染细菌情况

从表1中的数据可以看出，低温肉制品生产线中不同部位污染的微生物种类和数量不完全相同。原料和灌装环境中分离出的微生物种类和数量最多；其次是加工器具；再次是晾制间环境和未二次杀菌的产品。在一次杀菌后产品和成品中未获得微生物，这可能与计数平板的精度有关。从上面的数据可以推断出，产品经过灌装后，细菌总数有所上升，这可能与灌装间环境细菌数量较大密切相关；产品经过一次杀菌后，未获得微生物，但是经过包装后出现多种细菌，这可能与包装间环境和人员卫生状况有较大关系。从污染的细菌类型来看，有耐热的芽孢菌出现，如果杀菌不彻底会造成产品的变质。

2.2 生产线不同部位真菌的分离与培养

按照1.2.2方法对斩拌原料、加工器具、灌装环境、灌装后产品、晾制间环境、包装前产品、包装后未二次杀菌产品、成品8个样品进行了污染细菌情况分析，并使用孟加拉红培养基对其中的优势细菌进行了分离培养，按照1.2.4的方法对获得优势种类进行观察，数据见表2。

表2 生产线不同部位污染真菌情况

从上面的数据可以看出：在斩拌原料以及灌装后产品、灌装环境和晾制间样品中分离出了真菌，同时发现在灌装后，菌数有所增加，这可能是由灌装间环境污染造成的，在晾制间发现真菌也要引起足够的重视。

2.3 生产线不同部位优势细菌种类

按照1.2.5方法对生产线中污染的优势细菌(共7株)进行了分子生物学鉴定，具体种类及来源如下：

(1)Micrococcus luteus NCTC 2665(藤黄微球菌)。

该菌属于一种革兰氏阳性球菌，存在于土壤、灰尘、水、空气和哺乳动物皮肤等生境中。这种细菌也寄生在人类的口腔、粘膜、口咽和上呼吸道。

(2)Chryseobacterium hispanicum VP48(西班牙金黄杆菌)。

该菌属于一种革兰氏阴性杆菌，存在于淡水环境、土壤、海洋鱼类和人类等生境中，该菌也会引起人类的疾病。

(3)Staphylococcus edaphicus CCM 8730(土壤葡萄球菌)。

该菌在自然界中分布广泛，并占据着多种生态位。由于其普遍性和适应性，是人类、其他哺乳动物和鸟类的皮肤、皮肤腺和粘膜中的主要细菌群。

(4)Acinetobacter johnsonii ATCC 17909(约翰逊不动杆菌)。

该菌属于一种革兰阴性杆菌，通常存在于环境和动物体内，偶尔可定植人体皮肤，引起导管相关血流感染或腹膜透析相关腹膜炎等临床感染。

(5)Exiguobacterium indicum HHS 31(印度微小杆菌)。

该菌属于一种革兰氏阳性杆菌，也有一些菌种在对数生长期及稳定生长期为球状。具有周生鞭毛，不形成芽孢，是一类兼性厌氧菌。广泛存在于热泉、植物根际、空气、海洋等生境中。

(6)Kocuria carniphila CCM 132(嗜肉库克菌)。

该菌属于放线菌门中革兰氏阳性菌，在土壤和海洋中均有分布，以分布于土壤为主。

(7)Moraxella osloensis A1920(奥斯陆摩拉克菌)。

该菌属于一种革兰氏阴性球菌，存在于人类及动物的皮肤及消化道等处，能够引起人类及动物疾病。

2.4 生产线不同部位优势真菌种类

按照1.2.6方法对生产线中污染的优势细菌(共2株)进行了分子生物学鉴定，具体种类及来源如下。

(1)Candida boleticola CBS:6420(菌生假丝酵母)。

该菌又称为白色念珠菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道等，为条件致病菌。

(2)Cutaneotrichosporon curvatus CBS:5358(弯曲隐球菌)。

该菌是隐球菌的一种，为一种病菌，可导致隐球菌病。存在于土壤、鸟粪、尤其是鸽粪中大量存在，也可存在于人体的体表、口腔及粪便等环境中。

3 讨论

本文采用常规的微生物分离技术与手段，对低温肉制品生产线关键点的微生物污染情况进行了研究，初步确定了生产线受微生物污染的情况，从中分离出优势种类，使用分子生物学技术对其核糖体DNA特定序列进行扩增，纯化，测序，进行序列比对，获得其确切的种属信息。

从本文低温肉制品生产线关键点分离的物生物来源来看，主要是来自于土壤、粪便、人体体表、口腔及呼吸道等环境中，从污染的类群来看，主要是一些条件致病菌。这说明本条生产线的污染源可能主要来源于以下几个方面：第一，操作工人的工作鞋或者工作靴；第二，操作工人的工作服装清洗不及时或者不到位；第三，操作工人的防护用具佩戴不到位；第四，各个工作间之间互相联通，造成空气互相污染。这为企业生产线的优化及产品质量的控制与提升提供了重要的参考。