发酵肉制品风味分析及形成途径研究

于倩倩 李 聪 周 辉 李新福 徐宝才

江苏雨润肉类产业集团有限公司 肉品加工与质量控制国家重点实验室 江苏南京 210019 江苏雨润肉食品有限公司 江苏南京 211800

发酵肉制品是指通过在自然或手动操作下，发酵有益微生物使肉类具有独特风味而形成的一类易于长期保存的肉制品。因其独特的风味，且健康安全兼具保健功能，近年来深受大众的喜爱[1]。在适当的气候条件下，使用大量的盐腌制或者充足的干燥都可以将肉类保存下来。这些保存技术保证了肉制品在较低的水分活度值条件下进行存储，以保护它们免受腐败和病原菌的侵害[2]。一般而言，简单的腌制和干燥足以保存整块肉，但其他成分(碎肉，副产品和脂肪等)由于微生物不稳定性和自身的高氧化性不宜长期保存，需要额外的发酵过程，通常将瘦肉和脂肪混合，然后灌装入肠衣，最后利用动物天然肠衣制造较弱的厌氧环境，来维持肉类的发酵条件。经过广泛研究，肉类发酵是由某些乳酸菌引起的，这些乳酸菌在厌氧环境中存活以产生乳酸，然后将其干燥以进一步稳定和成熟产品。

1 发酵肉制品的种类

发酵肉制品的质量很大程度上取决于成品的发酵程度[3]。根据发酵程度，发酵肉制品可分为高酸发酵肉制品和低酸发酵肉制品，这种分类方法最能体现发酵肉制品的本质[4]。

1.1 低酸发酵肉制品

一般低酸度发酵肉制品的pH值≥5.5。对于低酸肉制品，在一定条件下，低温发酵和干燥会抑制细菌直至盐浓度达到一定水平(水活度值Aw值低于0.96)。低酸发酵干肉产品包括法国，前南斯拉夫，意大利，匈牙利萨拉米香肠，西班牙火腿，阿登火腿等。虽然它们在吸烟(仅吸烟的一部分)，霉菌生长(其中一些在表面上具有霉菌生长)和其他特征方面彼此不同，但它们在以下两个方面是一致的。

(1)发酵干燥时间长，即产品pH值高，脱水率也高，但没有干燥失效现象(变形，局部硬化等)。因此，必须通过延长水分移动过程来获得足够的Aw值。

(2)降低温度控制或不添加碳水化合物，成品的pH值会高于5.5，一般在5.8～6.2区间。

在酸化和干燥过程中，低酸发酵肉制品发生了以下变化。

(a)风味物质(非蛋白质氮化合物)会由于蛋白酶降解肌肉蛋白质产生，pH值会相对略微提高。

(b)脂肪分解酶降解脂肪，产生羟基和脂肪酸，增加酸度，没有酸败，从而形成美味。

(c)如果使用了硝酸盐，亚硝酸盐的消耗不显著。由于硝酸盐和亚硝酸盐本身的性质，以及烟熏和干燥的原因，低酸香肠中的亚硝酸盐仍然高达(50～100)×10-6mg/kg。

(d)Aw值由于干燥变小，直接导致没有耐盐性的微生物减少或消失，而且大多数病原微生物被抑制。事实上，只有李斯特菌和葡萄球菌才有机会成长。低温(<10℃)和低Aw可以抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

1.2 高酸发酵肉制品

与传统的低酸发酵肉制品不同，大多数高酸发酵肉制品都接种了发酵或发酵香肠的起子。用于接种的微生物具有能够发酵添加碳水化合物以产生酸的菌株。因此，成品发酵肉制品的pH值<5.4。

酸化和干燥过程主要导致以下反应。

(1)乳酸在碳水化合物降解的过程中形成，导致pH值<5.4。该pH值非常接近肉蛋白质的等电点，因此使肌肉蛋白质凝胶化并抑制大多数不需要的微生物。

(2)由于使用起子的香肠重量损失的15%～20%足以达到所需的Aw，因此重量损失通常低于低酸发酵肉制品的重量损失。

(3)低pH值和低Aw可以消除初始菌群，类似于低酸肉产品的变化。不同之处在于，由于pH值较低，葡萄球菌在高酸性肉制品中也受到抑制。

(4)蛋白酶降解减少肌肉蛋白，肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的数量，同时增加NPN化合物，肽，氨基酸和氨的浓度，使pH值略有增加。

(5)脂肪酸会由于某些发酵剂和肉类微生物水解脂肪的能力在脂肪水解的过程中形成，从而引起成品风味的改善。虽然在成熟期间酸的量增加，但没有酸败。

(6)亚硝酸残留量降至10×10-6mg/kg以下。

酸的发酵需要一定量的时间和条件，并且这些条件通常难以控制。因此，已经提出通过添加化学添加剂来代替发酵酸生产。但与之而来的问题是肌肉蛋白质会由于直接加酸导致快速凝固，从而影响产品的性质。因此，延迟酸化作用势在必行。

目前有两种更成功的酸化方法：将葡萄糖酸-δ-内酯混合并在肉中填充数小时以产生葡萄糖酸;添加一种特殊的有机酸涂层，加热并融化。根据包衣的性质不同，温度或是室温，或是50～65℃的高温。不完全氢化的植物油可作包衣。最常用的酸为柠檬酸和乳酸。

发酵和酸化相比，酸化时间短且细菌学安全。然而，通过发酵的香肠通常被认为具有比酸化剂生产的香肠有更好的感官特性和保质期。虽然酸化香肠是可以接受的，但它们必须在生产后不久出售以避免感官变化。

1.3 发酵肉制品加工工艺

发酵肉制品有很多种。由于原料、加工条件等不同，不同的产品有不同的加工工艺，但基本的加工原理和方法是相似的[5,6]。发酵肉制品的一般加工工艺为：生肉预处理、混合(添加辅料，孕育剂)灌装、发酵、干燥和固化熏制成品。最后进行切片和预包装进入市场流通。发酵肉制品种类较多，不同的产品因原辅料、加工条件等而具有不同的加工工艺，但其基本加工原理和方法是类似的。

2 发酵肉制品风味成分分析

食物味道是摄入口中的食物产生的感官印象的总和，包括味觉，嗅觉，疼痛，触觉等[7～9]。风味是食物的关键品质之一，主要由食物中的挥发性成分决定，决定了消费者对产品的偏好。发酵肉制品含有多种挥发性成分，比较复杂，而且大部分成分都极低。因此，两种或多种方法可用于同时分析并相互补充[10]。

2.1 发酵肉制品挥发性风味成分的常用提取方法

2.1.1 固相微萃取

固相微萃取(Solid-Phase Micro-Extraction，SPME)是一种将风味成分的提取，浓缩和分析相结合的过程，从提取到分析只需几十分钟。它的主要操作仪器只是一个方便的提取手柄和提取头。不同之处在于可伸缩引入的硬硅纤维头涂有不同的吸附层。在吸附取样期间，将针浸入液体或气体样品中，并在吸附达到平衡后缩回针。解吸分析直接在GC或LC进样器中进行[11]。其操作简单，检测快速，检测成本低，样品量少，是风味分析预处理中应用最广泛的方法。党亚丽[12](2008)对两种火腿用固相微萃取法提取，并利用气-质联用仪进行分析，结果显示两种火腿的风味组成相似，但各成分的含量存在明显差异。李鑫[13](2014)采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用法分析金华火腿风味成分，并对其分析条件进行优化，为监测金华火腿加工中的风味变化提供合适方法。目前，SPME技术已广泛应用于金华火腿宣威火腿等各种食品的风味分析。

2.1.2 超临界流体萃取

超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是利用超临界流体特性溶解和分离样品材料中的挥发性成分[14]。目前，主要的超临界流体萃取剂是临界温度低，密度高，低压，安全无毒的二氧化碳。超临界流体萃取不需要有毒有害的挥发性溶剂，也能够避免因热降解或其他因素而导致结果的不准确。Asep[15](2008)研究了可可粒的粒度，发酵，焙烧时间和焙烧温度对超临界流体技术提取可可脂的影响，结果表明减小颗粒，在合适的烘培时间和温度下可提高萃取的效率。林荣英[16](2000)分析了超临界流体技术在辣椒成分提取方面的应用，用超临界二氧化碳一级萃取二级分离的方法提取色素和辣素，并用超临界二氧化碳二级萃取和分离提取辣素和油脂。超临界流体萃取的特点是：萃取剂是一种常压、常温下的气体，萃取后容易与萃余液相及萃取组分离，操作获利能力较低，特别适用于天然物质的分离；温度和夹带剂调节超束缚流体的溶解性，通过逐渐提高温度和压力，将萃取组分引入所需产物中。

2.1.3 吹扫-捕集法

吹扫捕集法(Purge-trap，P&T)，也称为动态顶空萃取法，是一种非平衡动态连续萃取方法[17]。该方法是使样品连续通过惰性气体(通常是高纯氮气)，并取出样品空间中的挥发性风味成分，然后使用吸附剂(主要是多孔聚合物)或冷阱捕集。吹扫捕集法的优点是可以有效地分离低沸点和高沸点物质，并且在没有高温加热的情况下不会引起芳香物质的高温分解，并且其采样量小，受到基底的干扰小。李鑫[18](2014)对吹扫捕集自动进样装置用于肉品风味物质提取进行探索，针对显著影响因素再进行单因素和正交试验，确定吹扫捕集用于火腿风味物质提取的关键参数。国家标准HJ639-2012使用吹扫捕集法检测水中的有机挥发物质[19]。

2.1.4 加速溶剂萃取

加速溶剂萃取(Accelerated Solvent Extraction，ASE)是将样品加热至密封容器中高于沸点的温度，这是容器中气体压力的增加(通常在1 500～2 000psi之间)。同时，施加一定的压力以防止溶剂蒸发，从而提高提取效率。这是一种在高温和高压下使用有机溶剂自动提取的方法[20]。加速溶剂萃取法在风味成分的提取中被广泛使用，具有操作简单，省药，省时，安全，回收率高等优点。欧小群[21](2018)综述了加速溶剂萃取技术在食品安全检测中的应用，重点阐述加速溶剂萃取技术在真菌毒素、有毒污染物等食品安全检测领域中的应用现状。刘静[22](2002)把快速溶剂萃取称为解决固体、半固体样品前处理的新技术，在食品分析中具有高速和节约溶剂的优势，满足极低检出限的食品检测需处理大样品量的要求。该方法还用于检测环境中的多环芳烃和农药，国家标准GB/T19649-2005规定采用加速溶剂萃取法检测粮食中405种农药的残留。

2.2 检测发酵肉制品中挥发性风味成分的方法

2.2.1 气相色谱

气相色谱(Gas chromatography，GC)主要用于分析具有挥发性且在高温下不分解的组分，是风味分析的基本方法。它使用惰性气体作为流动相。每种组分具有不同的吸附容量，导致不同的操作速度，进而将样品与不同的组分进行分离并顺序进入检测器以进行检测。检测得到的色谱图出现在记录仪上，具体取决于响应的大小。江洋论述了气相色谱技术在食品安全检测中的应用分析，包括在新鲜程度、营养方面，食品中各种药类的残留以及各类风味物质和各类挥发物质的检测[23]。Jiang[24](2015)采用稳定同位素稀释气相色谱固相微萃取和纤维衍生法，开发了一种测定肉中盐酸克伦特罗的方法，通过中心复合设计优化了固相微萃取的条件。常见的检测器包括热导检测器(Thermal Conductivity Detector, TCD)，氢火焰离子化检测器(Flame Ionization Detector, FID)，电子捕获检测器(Electron Capture Detector, ECD)等。

2.2.2 气相色谱-质联用仪

气相色谱-质联用仪( Gas chromatography- Mass Spectrometry， GC- MS)是一种将质谱和气相色谱组合使用的方法，它是目前最广泛使用的风味检测方法之一。挥发性风味成分复杂且有许多未知成分，因此无法找到气相色谱定性分析的准确标准。这导致单个气相色谱不能充分满足风味成分分析的需要。气相色谱-质联用仪利用气相色谱分离混合物的组分，并且可以使用来自标准光谱的数据来比较质谱分析，分析物的定性测定是鉴定未知组分的最有效方法之一。GC-MS具有色谱灵敏度高，分离效率高，定量准确，质谱鉴定能力强，响应速度快，能够确定分子式的能力。同时，可以使用外标法或内标法进行组分混合物的定量分析，因此GC-MS在风味分析中具有广泛的应用。Cardador[25](2017)描述了使用气相色谱-质谱测定肉制品中14种消毒副产物的分析方法，检测的平均相对标准偏差为7.4%，整个过程的回收率在86%～95%之间。王强[26](2011)选取鸭肉制品酱鸭作为原料，结合气相色谱-质联用仪研究了酱鸭挥发性风味物质的分析方法、酱鸭的特征风味物质、风味活性化合物对酱鸭风味贡献的大小以及加工工艺对鸭肉挥发性风味物质的影响。

2.2.3 气相色谱-嗅闻仪

气相色谱-嗅觉测定法(Gas Chromatography-Olfactometry，GC-O)是一种将感官嗅探与仪器分析技术相结合的方法。它首先在GC柱端口安装一个分离端口，允许由气相色谱仪分离的组分通过载气输送，一部分输送到氢火焰离子化检测器，另一部分输送到嗅探端口。当探测器探测到样品中的成分时，嗅探器会嗅出成分的气味并记录香味和强度。徐永霞[27](2011)采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)提取清炖猪肉汤的香气成分，利用气相色谱-嗅闻技术进行分析，得到19种香气活性成分，并根据香气强度的大小确定了清炖猪肉汤中的关键香味化合物。

芳香化合物的鉴别技术可分为三种类型：(1)连续稀释法(Serial Dilution)[28]；(2)时间-强度法(Time Intensity)[29]；(3)频率检测法 (Frequency Detection, FD)[30]。

3 发酵肉制品风味形成途径

发酵肉制品中的挥发性化合物主要由不饱和脂肪酸氧化产生，并与蛋白质、肽和游离氨基酸进一步反应。主要挥发性化合物包括碳氢化合物(烷烃和甲基支链烷烃)、醛、醇、酮、甘油三酯和磷脂、β-丙交酯β-内酯、酯和其他化合物水解形成的游离脂肪酸。苯衍生物、胺、氨基化合物等的脱水和环化[31,32]。每种化合物对挥发性风味的影响取决于其特征香气和气味阈值。例如，烷烃几乎没有气味，5～6个碳原子的醛有草味，大量的己醛有酸味，有些酮有奶油味，内酯有果香。

3.1 蛋白质降解

蛋白质降解是指在蛋白质降解酶的作用下，将食品中的蛋白质降解为多肽和氨基酸，然后被人体吸收的过程。食用蛋白质的食品不能直接被人体吸收，而是通过蛋白质降解酶的作用降解为多肽和氨基酸，对人体具有重要意义。蛋白质降解在发酵肉制品风味形成中起着重要作用。蛋白质降解形成许多小分子物质，如氨、肽、氨基酸等。这些物质大多是肉类产品的重要风味前体，如氨基酸，可进一步水解成游离氨基酸和小肽，对产品的口感有显著影响；小肽和氨基酸可进一步与糖结合发生美拉德(Mailand)反应，对发酵肉的风味有效果。Papuc[33](2017)分析了中性蛋白酶在肌肉蛋白质降解和肉质嫩度中的作用，指出蛋白酶是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用。Almeida[34](2018)发现了一种利用原生培养基培养的低钠发酵香肠模型中肉蛋白质降解的方法，指出在低钠发酵香肠的加工过程中使用所选菌株可对小肽和游离氨基酸产生积极影响。

3.2 美拉德反应

美拉德反应，又称非酶褐变，是还原糖和氨基酸(如肽、蛋白质、氨基酸)及羰基化合物之间的反应，是肉制品中产生风味成分的重要途径之一[35]。美拉德反应涉及还原糖中胺化合物与羰基的缩合，生成糖基胺，然后被脱氧邻酮酸糖(如呋喃酮，二羰基化合物，糠醛和羟基酮)脱水和降解。此外，美拉德反应产生的二羰基化合物可以进一步与硫胺素的降解产物反应，硫胺素已脂质形成独特的肉质物质。虽然氨基酸与其他化合物反应产生挥发性的味道，但是糖和游离氨基酸的美拉德反应可以产生带有一些芳香气味(坚果、草、土壤等)的吡嗪。然而，由于干燥和发酵阶段的温度远低于烹饪温度，发酵肉制品中产生的吡嗪通常较少，火腿中主要的吡嗪成分是甲基吡嗪。它有明显的烤坚果味。果糖与甘氨酸反应形成牛肉汤香精，与谷氨酸反应形成鸡肉香精，与赖氨酸反应形成炸土豆香精，与蛋氨酸反应形成豆汤香精；葡萄糖与谷氨酸反应生成鸡肉香精，赖氨酸生成炸土豆香精，与蛋氨酸反应生成卷心菜花味，和苯丙氨酸产生焦糖味[36]。Gupta[37](2018)指出在发酵过程中，美拉德反应有时通过破坏过敏原的表位和降低过敏原潜力而有益，而过敏反应的恶化也可能由于表位基序或新过敏原产生的变化而发生。赵景丽[38](2013)分析了含硫氨基酸美拉德反应在火腿挥发性风味物质形成中的作用，结果显示半胱氨酸和蛋氨酸参与的美拉德反应都会产生属于金华火腿风味物质的挥发性产物。

3.3 脂质氧化

脂肪氧化是肉制品加工过程中一个重要的生化反应过程，对肉的风味形成有着重要的影响。通常，脂质在60℃下自氧化，在200～300℃下大量降解。不饱和脂肪酸本身可以被氧化，并且在水解成游离脂肪酸后更容易被氧化，其主要产物是形成脂肪酸的过氧化物。这些产品没有气味，但很快就会形成一些醛类、酮类、酸和其他具有典型风味的成分。醇主要是由肉豆蔻酸产生的1-丙醇和1-丁醇等特异性脂质氧化分解而成。辛醇由亚油酸产生，亚油酸由油酸产生，具有较高的气味阈值。脂肪酸氧化形成的醛可与其他化合物反应生成调味物质，而己醛是亚油酸氧化产生的一种特征性醛。己醛和戊醛、糠醛、2-己醛和2-庚醛与挥发性风味有很大关系。阈值为500～600μg/L，表现出清爽、金属味和果味。不饱和醛进一步氧化形成短链醛，该短链醛自氧化并加热形成二烯基醛和正己烷。Barden[39](2016)综述了低水分食物中的脂质氧化，总结了目前关于低水分食品中脂质氧化的理论和现有研究，还讨论了需要注意的研究缺陷和评估低水分食物中脂质氧化的新方法。蒲健[40](1999)讨论了肉食品中脂类氧化的测定方法，包括乙醛、MDA等的测定，指出氧化降解使得产品的质量如颜色、香味、组织结构甚至营养成分等都发生了变化。

3.4 发酵剂

发酵肉制品所用的发酵剂对挥发性化合物的形成有重要作用，一些挥发性化合物的形成受发酵剂类型的影响。例如，丁二酮、羟基丁酮和1,3-丁二醇有一种黄油味，与金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的添加有关；2-戊酮和2-己酮有一种酸洗味，乳白色葡萄球菌和葡甘醇葡萄球菌、酒井乳酸杆菌和金黄色葡萄球菌、粘质葡萄球菌和葡萄球菌的组合具有酸洗味。香肠中的葡萄球菌有助于提高感官质量和缩短成熟时间；金黄色葡萄球菌产生大量甲基酮、支链醛和脂肪酸乙酯，使肉制品具有果香。大多数挥发性化合物会随着初始接种物的水平和成熟度而变化。金黄色葡萄球菌和棒状杆菌能增加发酵肉制品的色泽和风味，使不饱和脂肪酸的氧化受到抑制，影响挥发性化合物的组成。此外，葡萄球菌能抑制亚油酸的氧化，而在没有锰的情况下，乳酸菌不能达到同样的抑制效果。干酪乳杆菌和植物乳杆菌诱导的蛋白质降解更为明显。在传统的发酵意大利香肠中，将短乳杆菌或曼尼德巴利酵母菌和金黄色葡萄球菌混合使用时，存在一种重要的蛋白质分解模式。金黄色葡萄球菌单独作为启动剂时，蛋白质分解和未接种香肠完全相同，这表明乳酸杆菌在蛋白质水解中起着重要作用[41]。Sanz[42](2002)为获得适合肉制品发酵的优良乳酸菌菌株，对来源于自然发酵肉制品中的25株乳酸菌进行筛选，挑选出3株弯曲乳杆菌均具有较强的增殖及产酸能力，均可作为潜在的开发肉制品发酵剂的出发菌株。Casaburi[43](2007)利用传统发酵香肠中分离的木葡萄球菌与酸化乳杆菌的酸化菌株组合用作生产发酵香肠的发酵剂，开发了两种配方，将蛋白水解与相同的菌株相结合，并在开始的产物中检测到蛋白水解和脂解活性。

4 发酵肉制品的安全性

发酵肉制品的安全性主要是要注意四个方面。

(1)金黄色葡萄球菌作为鲜肉中常见的污染菌，在一般情况下由于其他腐败微生物菌群，金黄色葡萄球菌不能很好地生长。随着Aw值的降低和其对盐和亚硝酸盐的高耐受性，会促进有利于金黄色葡萄球菌生长条件的形成。因此，肉类中的金黄色葡萄球菌可以在发酵前或发酵过程中生长并产生肠毒素，需要在发酵结束时进行检测。

(2)发酵肉制品通常是在高温下未经过热处理且不能保证不含致病菌的肉制品。产品可能含有沙门氏菌和李斯特菌等病原菌，需要在生产过程中严格控制。

(3)由霉菌成熟的肉制品可能有霉菌生长的真菌毒素，需要进行严格的筛选至安全霉菌。

(4)参与生物胺形成的微生物主要是一些乳酸杆菌。在组氨酸和酪氨酸脱羧后，氨基酸可以脱羧形成胺，例如组胺和酪胺。只有当香肠中含有大量组氨酸脱羧酶并且组氨酸含量远高于正常时，才会产生大量的组胺。这些条件表明肉在高温下储存或在加工前已经储存了很长时间。因此，选择优质生肉并注意，使用该起子不应含有该菌株的氨基酸脱羧活性，是避免生物胺损伤发生的基本措施。

在今天的世界经济一体化中，发酵肉制品很可能将受感染地区的动物病毒引入未感染的地区或通过国际贸易控制感染的地区。在特别关注的动物病毒中，有口蹄疫，猪瘟和猪霍乱等病毒。

发酵肉制品是一种非常稳定的产品。在一般情况下，根据正常流程进行生产的发酵肉食品不会产生变质。但是，如果在储存过程中香肠表面有冷凝水，或者香肠表面和预包装产品的包装薄膜之间有冷凝水，然后还会有细菌生长从而导致产品变质。

5 结论

发酵是最古老、最原始的肉类储藏方式，发酵肉制品因具有较低的Aw值和pH值使其得以保存。在干燥和发酵过程中产生的酸、醇、脂肪、非蛋白肽含氮化合物等赋予发酵肉制品独特的风味。本文首先介绍了发酵肉制品的种类和加工方法，然后介绍了发酵肉制品挥发性风味成分的常用提取方法和成分检测方法。最后，分析了四种发酵肉制品风味的形成途径。本文为发酵肉制品的生产和推广提供了重要参考。