短链脂肪酸提取与检测的研究进展*

高 冰，于秋颖，贾海莲，苏 军，邰大鹏，李梦格，戈 娜

(1.包头医学院营养与食品健康研究所，内蒙古 包头 014040；2.包头市环境监测站；3.内蒙古自治区综合疾病预防控制中心；4.包头医学院2012级预防医学本科班)

众多研究已表明，肠道菌群失衡与多种肝病的发生密切相关，且关于“肠—肝轴”的研究也越来越受到关注。SCFA为碳原子数在6个以下的脂肪酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸等。食物中抗性淀粉、膳食纤维、糖醇和低聚糖等在结肠内被肠道微生物发酵的产物，是人体内短链脂肪酸的主要来源。目前，对生物样品中SCFA的测定被应用于反映肠道菌群状况、结肠黏膜细胞活性以及某些疾病诊断和治疗的辅助手段。

1 短链脂肪酸检测的生物样品种类

由于粪便及肠内容物与肠道特殊的关系，因此目前常被用于短链脂肪酸定性定量研究。现阶段除了对测定粪便及肠内容物中SCFA外，还有很多生物样品被应用于该领域的研究，如血液、唾液和呼出气体等。

1.1唾液 肠腔内产生的短链脂肪酸，一部分在肠道中被利用，通过口腔粘膜和细胞膜的渗透进入唾液，另一部分进入血液循环至肺部，并随呼吸作用到达口腔，进入唾液。唾液成分包括少量蛋白质、电解质、激素、DNA、RNA以及其它物质等。与其他检测物相比，唾液分析具有取样简单、临床检验快速、适应性好等特点，基于血液物质和唾液成分的相关性，可用于多种疾病的临床诊断。赵晓亚等[1]对41例健康志愿者唾液中7种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸)定量分析，建立了气相色谱氢火焰离子化检测器法测定人体唾液成分。

1.2尿液 尿液中SCFA含量非常低，但它们的羟化物如2-羟异戊酸、β-羟丁酸以及乙酰乙酸、乳酸、富马酸等短链有机酸的含量很高[2]。孙树英等[3]为更有利于临床上的诊断和治疗，曾以气相色谱法测定了人尿液中的短链脂肪酸，并优化了气相色谱法测定短链脂肪酸的实验条件。王洪存等[4]用气相色谱法对人尿中短链脂肪酸进行了测定实验，以10 % 改性聚乙二醇-20000-I(FFAP)磷酸为固定液，探索了气相色谱分离条件，进行了线性关系、精密度和回收率实验。同时在正常人尿样中检出乙酸和微量丙酸。上述研究均获得良好的实验结果，并对临床疾病的诊断具有较好的辅助作用。

1.3粪便 粪便是人体的主代谢物，在正常生理条件下粪便中短链脂肪酸的种类及其丰度较为稳定，同时其变化可灵敏地反应炎症病理条件下肠道微环境的改变情况，因此，对肠道短链脂肪酸检测可评估肠道微环境。且粪便作为测定短链脂肪酸的生物样品较其他种类物样品有采样简单、样品易获得、方便储存的优点。赵晓亚等[5]建立的顶空气相色谱-串联质谱法(HS-GC/MS)在人的粪便样本中检测到8个短链脂肪酸，其中主要为乙酸、丙酸、丁酸。测定大鼠粪便同样测到了8个SCFA，与人的粪便样品测定结果一致，主要仍为乙酸、丙酸、丙酸。刘娟等[6]建立了一种离子排斥色谱方法分离测定了人体粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸5种短链脂肪酸。吴水芸等[7]利用气相色谱-质谱联用法测定粪便中的短链脂肪酸，以大鼠粪便微生物样品，成功检测到了短链脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸。由诸多的研究报道可以看出，因粪便取样量大，样品易于获得和提取，测定效果好等优点，其已成为检测短链脂肪酸最为常用的生物样品。

1.4血浆 血清中含有乳酸、乙酸和丙酮酸，血小板浓缩液中主要含有乳酸、乙酸、丙酮酸和琥珀酸。由于大部分乙酸都在外周组织发挥作用，在肠道中被吸收的乙酸量极少；大部分丙酸因参与肝异生作用而在肝脏被代谢；而丁酸的主要利用部位为结肠，所以人血浆中的短链脂肪酸以乙酸为主，其他种类如丙酸、丁酸含量则很少。赵晓亚等[5]以HS-GC/MS法测定人和大鼠血浆中短链脂肪酸，测得人血浆中短链脂肪酸主要以乙酸为主，其他成分较少。同时，测定大鼠血浆中短链脂肪酸的结果与测定人血浆中短链脂肪酸结果基本一致。这一结果符合人体短链脂肪酸的代谢分布情况，也正因如此，在对人体内短链脂肪酸进行分析研究时，所选的生物样品多为粪便而非血浆。

2 短链脂肪酸的提取方法

短链脂肪酸的独特性质决定了其测定时的样品前处理方法不同于长、中链脂肪酸。同时，不同的检测手段以及不同性质的生物样品也导致它们的前处理方法不尽相同。

2.1蒸馏法 1878年Brieger首次提出直接蒸馏法，经过不断改良为蒸汽蒸馏法、真空蒸馏法等[1]。蒸馏法存在样品需求量大、强酸酸化样品导致蛋白和碳水化合物的消化产物污染蒸汽、样品乙酰基分解导致乙酸值不准确等缺点，故蒸馏法现已不常使用。

2.2离心超滤法 生物样品可通过高速离心后再通过半透膜进行分离。刘娟等[6]利用离子排斥色谱法测定人体粪便中五种短链脂肪酸，对粪样进行了以下处理，取样品分别加NaOH溶液和蒸馏水，涡旋器振荡，13000 r /min离心5 min，取上清液，用0.2 μm薄膜过滤后，冻存待分析。赵晓亚等[1]在以气相色谱法对人唾液短链脂肪酸进行分析时，对唾液样品进行了以14000 r / min离心10 min，取上清液，-80℃保存备用的处理。同时，在测定之前加入了适量HCl酸化，使短链脂肪酸处于游离态，以便于测定。

2.3萃取法 常用的萃取剂有乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷和氯仿等。先将粪便配成悬液，再加入酸使脂肪酸更易被有机溶剂提取[3]。贾益群等[8]在利用粪便样品检测短链脂肪酸时，先将纯水溶解的样品离心过滤后加硫酸溶液再加乙醚溶液，再次离心后取上层乙醚溶液待分析备用。液-固萃取法在测定粪水和尿液中的SCFA时也常被使用。这种方法能更好地对一些有机酸进行定量。缺点是较液-液萃取法更加费时费力。固相微萃取(SPME)基于吸附和解析进行样品处理，是从多种底物中提取半挥发性和挥发性物质的一种新技术[2]。其萃取头为有聚合物薄膜的熔融石英纤维，利用该萃取头可一步完成提取、浓缩、分离步骤。在分析SCFA时常常需要结合衍生化技术来提高SPME的效益及灵敏度。血浆样品常常需要经过去蛋白将样品纯化这一重要步骤后再进行萃取。液-液萃取法是最常用的方法之一，一般使用多种有机溶剂或其混合物作为有机酸的萃取剂，甲醇和氯仿作为典型溶剂可将血清蛋白中的脂肪酸释放出来。萃取法较其他方法稍显复杂，但是样品的处理效果更好一些，试验结果更加准确。

3 短链脂肪酸的检测方法

3.1气相色谱法(GC) GC是目前国内应用最为广泛而常见的检测脂肪酸的方法，具有分离度好、灵敏度高、检出限低、重复性好等特点。分析对象一般为热稳定性、可挥发性样品，不可挥发和热稳定性不好的样品经过衍生化后，挥发性和热稳定性增加，其极性降低，可使用GC测定。包娜然等[9]采用气相色谱法测定了血小板浓缩液和血清中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸。赵晓亚等[1]用气相色谱法定量分析了人唾液中的七种短链脂肪，并已建立了简单、快速、准确的气相色谱-氢火焰离子化检测器法，奠定检测唾液中与疾病相关的挥发性生物标记物方法学的基础。GC衍生化简单，仅需把羧酸衍生成酯，可以降低这些挥发性酸的蒸发损失，用有机溶剂直接提取后进样分析。贾益群等[8]建立了GC检测粪便中短链脂肪酸的定性、定量方法，分离效果好，回收率高，无需衍生化，使用乙醚-硫酸 (50 %) 在15 min内可以分离出生物样品中的6种短链脂肪酸，并可以整体诊断体内厌氧菌的变化。采用衍生化和非衍生化两种方法测定人血清中的脂肪酸含量，采用正己烷-异丙醇 (4∶1) 提取血清中的游离脂肪酸后直接经GC进样，结果显示非衍生化方法具有操作步骤少，中、短链游离脂肪酸回收率高的优点[8]。

3.2高效液相色谱法(HPLC) HPLC对大分子、高沸点、热稳定性差、极性强的化合物分离具有优势，准确度高，分析过程条件相对温和。紫外(UV)检测法测定唾液、血浆、粪便和尿液中的SCFA，真空蒸馏生物样品，在碱性条件下冻干浓缩，通过磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱上分离，测定结果与气相色谱所得结果具有一致性[9]。HPLC可选用的仪器较多，如电化学、化学、紫外和荧光发光检测器。电化学检测器灵敏度和特异性高，可以不用衍生化直接检测脂肪酸，而荧光和紫外检测器的重现性好。现通常先将SCFA衍生化后再采用荧光或紫外检测器进行检测。

3.3气相色谱-质谱联用法(GC-MS) GC-MS灵敏度高、分离度好、分辨率高、重复性佳、检出限低，其优势在于微量或痕量分析，可对未知化合物进行快速检索和鉴定。吴水芸等[7]建立了快速检测粪便样品中的短链脂肪酸的GC-MS法，对其应用于肠道疾病辅助诊断进行了探究。最终结果是在所有标本中均检出多种短链脂肪酸，其种类主要有乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。在生理条件下，人与鼠短链脂肪酸的种类和相对丰度比都十分相似，同时发现肠炎可使粪便中除乙酸外的其他短链脂肪酸的相对丰度下降，其中，尤以丁酸下降最为明显[10]。结果表明GC-MS法有可能应用于肠炎等肠道疾病的辅助诊断。

3.4离子色谱法(ICE) ICE方法也较成熟，使用较多，主要用于分析细菌终末代谢酸。刘娟等[6]建立了一种离子排斥色谱分离测定人粪便样品中五种短链脂肪酸的方法。以体积分数0.1 % 磷酸为流动相、提取的样品在50 ℃下用Shodex Rspak KC-811离子排斥柱分离，紫外检测器在210 nm处测定其中的有机酸，测得结果令人满意，同时优化了色谱分离条件。

3.5毛细管电泳法(CE) CE测定SCFA的优点是

简便快速、反应条件温和、样品量少等，有等速电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管区带电泳等方法。CE用磷酸缓冲液(pH 6.0)，甲醇作为改良剂可直接分离并在波长200 nm下检测尿中包括 SCFA在内的多种有机酸，可对SCFA进行快速有效的分离[11]。

4 展望

通过生物样本中短链脂肪酸的测定，可以研究肠道菌群的种类及含量的变化与某些疾病之间的关系，从而对疾病的诊断和治疗有一定的辅助作用。同时针对检测短链脂肪酸的生物样品，目前利用较多的为粪便样品，关于其他生物样品如血浆、呼出气体、肠内容物短链脂肪酸的检测研究还十分匮乏，今后应在除粪便以外的生物样品中加大研究力度。同样应在研究的同时探索更加简便、快捷、样品需求量小、分离效果好、省时省力的样品处理方法。最重要的是，关于短链脂肪酸的检测，现大多数研究均着眼于气相色谱法检测短链脂肪酸，利用色谱质谱联用技术，可使得脂肪酸的定量、定性得到更深入的研究，为相关的疾病的临床诊治提供可靠依据。所以，应在日后的研究中不断优化液相色谱、液相色谱-质谱联用法等方法的实验条件，以求得更加高效、准确、精密度灵敏度更高的检测方式。