深圳和太原PM2.5样品致突变作用研究

郑 凯，王冰玉，徐新云*，耿 红，黄海燕刘 威龙鼎新

(1.深圳市疾病预防控制中心环境与健康所，广东 深圳 518055；2.南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001；3.山西大学环境科学研究所，山西 太原 030006)

大气细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指空气颗粒物中动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物，是空气污染物的主要成分之一。PM2.5的成分十分复杂，包含多环芳烃、重金属离子、硝酸盐、亚硝酸盐等多种具有致突变性和致癌性物质，对人类健康造成了很大威胁[1-3]。PM2.5由于粒径小、比表面积大、活性强、极易富集有毒有害物质，而且可较长时间停留在空气中，易被吸入肺泡并沉积，损害人体健康，当接触达到一定剂量后能够引起呼吸系统疾病、心血管疾病和肺癌等多种疾病的发生[4-6]，国际癌症机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)于2013年发布报告将PM2.5列为致癌物。Ames试验是1975由Bruce N.Ames建立的一种检测致突变性的试验[7-8]，其原理是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株在含微量组氨酸的培养基中，只有少数的细菌发生自发回复突变，形成在显微镜下才能看到的菌落。受诱变剂作用后，大量的细菌发生回复突变，自行合成组氨酸，形成肉眼可见的菌落。TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均属于组氨酸缺陷型菌株，因此在Ames试验中被广泛使用。

山西太原作为我国的煤炭和重工业基地，是受雾霾天气影响非常严重的地区之一；深圳作为我国经济特区之一，其环境质量虽然在优良水平，但近几年也有少数时间受雾霾天气的侵扰。众所周知，在雾霾的组成成分中PM2.5对人类的健康影响大，因此本文利用Ames试验中组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，使用平板渗入法通过Ames试验检测深圳和山西太原PM2.5样品是否具有致突变作用，为深入研究PM2.5的致癌致突变分子机制、保护人类健康提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂

组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535购自美国MOLTOX公司；生物分子学琼脂糖(certified molecular biology agarose)购自Bio-Rad公司；氧化型辅酶Ⅱ钠盐NADP Na2购自Solarbio公司；哺乳动物微粒体酶(S9)购自美国MOLTOX公司；D-生物素和L-组氨酸购自美国Sigma公司，D-葡萄糖6-磷酸钠盐(D-glucose 6-phosphate sodium salt)、四环素、氨苄青霉素购自Aladdin-e公司，营养肉汤和营养琼脂购自广州环凯生物科技有限公司，葡萄糖购自购自美国Sigma公司，迭氮钠购自天津市福晨化学试剂厂，敌克松(fenaminosulf)购自AccuStandard公司，2-氨基芴(2-aminofluorene)购自J&K ScientificLTD公司，1,8-二羟基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)购自美国AcrosOrganics公司。

1.2 菌株鉴定

按常规方法进行自发回变率、组氨酸缺陷型、四环素抗性、脂多糖屏障(raf)缺陷型、R因子(氨苄青霉素抗性)和紫外损伤(uvrB)修复的鉴定。

1.3 PM2.5样品制备

分别在深圳和太原两地采集PM2.5样品，使用中流量大气采样器TH-150F，采样流速100 L/min，采样时间24 h，使用直径为90 mm的滤膜收集PM2.5颗粒。将分别在深圳和太原采集好的3张PM2.5的滤膜称重后剪成2 cm×2 cm大小分别放于带标记的两个烧杯中，并使有颗粒的一面朝上，加150 mL超纯水使滤膜完全侵没，用一层锡箔纸使烧杯口密封，超声提取30 min，用干净的镊子将烧杯中的滤膜取出，待PM2.5样品悬浊液冷却后分别转移到两个真空冷冻物料盘中并标记，用锡箔纸将物料盘口密封后放于-80℃冰箱冷冻24 h，再将物料盘口的锡箔纸取下，用封口膜密封并在封口膜上点许多密集的小孔，放在真空冷冻干燥机中干燥24 h(干燥时间由样品的多少决定)使PM2.5完全干燥，将物料盘敞口放在无菌工作台中照紫外灯2 h，用超纯水溶解PM2.5样品，收集PM2.5样品溶液，-20℃保存待用。

1.4 Ames试验

将深圳和太原PM2.5样品分别用灭菌的超纯水稀释至0.4、1.0、2.0和4.0 mg/mL共4个浓度，作为受试物进行Ames试验[7-9]。同时设置溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组不加S9时，TA97、TA98和TA102按每皿加入50 μg的敌克松，TA100和TA1535按每皿加入1.5 μg的叠氮钠；阳性对照组加S9时，TA97、TA98、TA100和TA102按每皿加入10 μg的2-氨基芴，TA1535按每皿加入50 μg的二羟基蒽醌。采用平板渗入法，在2 mL顶层琼脂中分别加入0.1 mL的菌液和0.1 mL的受试物，代谢活化组加入0.5 mL S9混合液，混匀后倒入底层培养基平板上并铺平。同时设置空白对照组(即阴性对照组或溶剂对照组)和阳性对照组。每个组均设3个平行皿，37℃培养48 h后，计数每个平皿的回变菌落数。

1.5 统计分析

实验数据以xˉ±s表示，所有实验重复3次，用SPSS 24.0和Excel进行统计分析，各样本实验组和对照组以及加S9混合液和不加S9混合液的均数差异分析采用单因素t检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 菌株鉴定结果

组氨酸鉴定：5种菌株在不加组氨酸的培养基上均不能生长，在加入组氨酸的培养基上均能生长。raf鉴定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在结晶紫渗透的培养基区域上均有抑制带，TA1535菌株在结晶紫渗透的培养基区域上没有抑制带。四环素抗性鉴定：只有TA102菌株在有四环素的区域生长，其余4种菌株不能生长，只有TA102菌株具有抗四环素效应。R因子鉴定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在氨苄青霉素带周围可以生长，这4种菌株具有抗氨苄青霉素效应，说明具有R因子，TA1535菌株在氨苄青霉素带周围生长受抑制，不具有抗氨苄青霉素效应，说明不具有R因子。uvrB修复缺陷鉴定：TA97、TA98、TA100和TA1535菌株仅在没有紫外线照射过的一半培养基上生长，为uvrB修复缺陷型菌株，TA102菌株经紫外线照射过后能生长，TA102菌株具有uvrB修复。自发回变率的测定：5种菌株的自发回变率均在标准范围之内。菌株基因型和自发回变鉴定结果均符合使用标准，见表1。

表1 鼠伤寒沙门菌5种菌株生物学特性鉴定结果和自发回变率

2.2 深圳样品的Ames试验结果

4种不同浓度的深圳PM2.5样品的水溶液加S9混合液与不加S9混合液均引起TA97回变菌落数大于空白对照组(即阴性对照组或溶剂对照组)的2倍，可判为Ames试验阳性。TA98在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时加S9混合液后回变菌落数达到(34.0±9.1)个/皿，超过了阴性对照组[(14.3±2.6)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA100在PM2.5样品浓度为100 μg/皿和200 μg/皿时不加S9混合液的回变菌落数达到(408.0±42.8)和(2 726.0±615.9)个/皿，超过了阴性对照组[(172.0±14.7)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA100在PM2.5样品浓度为200 μg/皿和400 μg/皿时加S9混合液的回变菌落数达到(2896.7±175.1)和(2201.3±228.6)个/皿，超过了阴性对照组[(153.3±14.5)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA102在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时加S9混合液的回变菌落数达到(312.0±23.0)个/皿，超过了阴性对照组[(149.3±26.2)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA1535在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时不加S9混合液的回变菌落数达到(32.3±1.7)个/皿，与阴性对照组[(26.0±0.8)个/皿]相比有显著性差异(P＜0.01)。TA97在 PM2.5样品浓度为200 μg/皿和400 μg/皿时加S9混合液后菌落回变数达到(1 358.7±79.8)个/皿、(1 586.7±101.5)个/皿，分别与不加S9混合液的菌落回变数(900±46.3)个/皿、(1 039.3±68.9)个/皿相比差异有统计学意义(P＜0.01)。TA100和TA102在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时加S9混合液后菌落回变数达到(2 201.3±228.6)个/皿和(312.0±23.0)个/皿，分别与不加S9混合液的菌落回变数(124.7±9.7)个/皿和(157.7±19.9)个/皿相比差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.3 太原样品的Ames试验结果

四种不同浓度的太原PM2.5样品的水溶液加S9混合液与不加S9混合液均引起TA97回变菌落数大于空白对照组(即阴性对照组或溶剂对照组)的2倍，可判为Ames试验阳性。TA98在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时不加S9混合液后回变菌落数达到(98.3±15.1)个/皿，超过了阴性对照组[(19.3±5.7)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA98在PM2.5样品浓度为40、200和400 μg/皿时加S9混合液后回变菌落数达到(85.0±5.4)、(33.0±3.6)和(141.0±8.2)个/皿，超过了阴性对照组[(14.3±2.6)个/皿]的 2倍，可判为 Ames试验阳性。TA100在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时不加S9混合液后回变菌落数达到(926.7±33.0)个/皿，超过了阴性对照组[(172.0±14.7)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA100在PM2.5样品浓度为40和400 μg/皿时加S9混合液后回变菌落数达到(425.3±21.7)和(5 125.3±215.6)个/皿，超过了阴性对照组[(153.3±14.5)个/皿]的2倍，可判为Ames试验阳性。TA102在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时加S9混合液后菌落回变数达到(247.0±41.1)个/皿，与阴性对照组[(149.3±26.2)个/皿]相比差异有统计学意义(P＜0.05)。TA97在PM2.5样品浓度为40和200 μg/皿时加S9混合液后菌落回变数达到(2 970.7±343.2)个/皿和(3 428.0±295.2)个/皿，分别与不加S9混合液的菌落回变数(370.0±76.1)个/皿和(1 754.7±137.2)个/皿相比差异有统计学意义(P＜0.01)。TA98和TA100在PM2.5样品浓度为400 μg/皿时加S9混合液后菌落回变数达到(141.0±8.2)个/皿和(5 125.3±215.6)个/皿，分别与不加S9混合液的菌落回变数(98.3±15.1)个/皿和(926.7±33.0)个/皿相比差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

表2 深圳与太原PM2.5样品的Ames试验菌株自发回变数结果

3 讨论

本试验结果显示广东深圳和山西太原两个地区的PM2.5均具有致突变性，Bocchi[10]等人研究结果显示，PM2.5的提取物能够引起DNA损伤并在菌株回复突变试验的结果中表明具有致突变性，这与本文试验结果一致。

由于PM2.5的直径比较小，可通过呼吸系统经支气管直接进入到肺泡深处，并在肺泡沉积，达到一定剂量后可引起机体发生炎症反应、氧化应激反应以及诱导基因突变，对人体健康造成严重危害。最近几年来我国部分城市出现雾霾现象越来越严重，特别是京津冀、长江三角洲及珠江三角洲等地区的雾霾现象更为明显。有研究表明，杭州在2001年雾霾天气只有12天，而在2013年雾霾天气增加到293天[11]。雾霾天气的增加对人群健康都来很大影响，其中雾霾中对人类健康影响最大的部分是PM2.5。文献报道PM2.5暴露与肺癌的形成密切相关，PM2.5含有的硝酸盐、亚硝酸盐等化合物以及重金属元素能够经呼吸道进入肺泡深部，并在肺泡深部沉积，直接或者间接的作用与支气管粘膜，引起肺上皮细胞发生基因突变[12]。随着近20年来的雾霾天气加重，我国肺癌发病率也明显升高。流行病学调查结果表明，昆山市2006年肺癌发病率为48.58/100万，而2015年肺癌发病率增加到77.72/100万，同比增长59.98%[13]；江西省2010—2014年肺癌发病率由38.62/100万上升至43.92/100万，同比增长13.72%[14]；江苏省淮安市2009年肺癌发病率为28.36/100万，2013年肺癌发病率上升到40.17/100万，同比增长41.64%[15]。这些研究表明，近年来肺癌发病率增加与雾霾天气增重有着密切的关系。

由于PM2.5成分比较复杂，现有资料表明，PM2.5含有大量的重金属和多环芳烃类化学物，而部分重金属和多环芳烃具有致突变性和潜在致癌性[16-18]。Gilli报道意大利都灵环境中PM2.5具有致突变性[19]，Belcik发现PM2.5具有基因毒性与细胞毒性[20]。本文采用Ames试验检测分析深圳和太原PM2.5样品是否具有致突变作用，Ames试验是检测环境污染物或外来化学物质致突变作用的经典实验，如果样品在不加S9条件下引起测试菌株突变称为直接致突变作用，如果样品需要在加S9条件下通过体内代谢活化才能引起测试菌株突变，则称之为间接致突变作用。本文利用5种组氨酸缺陷型沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535检测广东深圳和山西太原两地区PM2.5样品的致突变作用，本试验设立阳性对照组在加S9与不加S9活化条件下，5种菌株的回变菌落数均超过阴性对照组回变菌落数的2倍，说明本试验的研究体系完全符合要求而且具有可行性。加S9与不加S9活化条件下，TA97菌株在深圳和太原两个地区PM2.5样品各个浓度的回变菌落数均超过阴性对照组2倍，深圳和太原两个地区的PM2.5样品Ames试验判为阳性，且加S9活化后回变菌落数明显升高，说明深圳和太原两地区PM2.5同时具有直接致突变和间接致突变作用。虽然本文使用的深圳和太原PM2.5样品暂未公布成分检测结果，但有作者报道太原PM2.5含As、Cd、Cu、Ni、Pb等重金属浓度较高[16]，文献报道As、Cd、Ni都具有一定的致癌致突变作用，可引起癌基因表达改变[17-18]，因此本文获得的Ames实验结果是非常有价值的，充分说明深圳和太原PM2.5样品中存在一些致突变环境污染物，对于今后深入研究雾霾致癌致突变的分子机制提供了科学依据，同时对于保护环境和保护人群健康具有十分重要的理论意义与科学基础。