PM2.5对支气管上皮细胞DNA损伤作用研究

王冰玉，郑 凯，徐新云*，谢红卫*，于军晖龙鼎新

(1.南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳421001；2.深圳市疾病预防控制中心环境与健康所，广东 深圳 518055)

2013年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将室外空气污染被归类为一类致癌物质，而室外空气污染的主要成分——大气颗粒物也被归类为致癌物[1-2]。大气细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)是一种直径≤2.5 μm的空气污染物，其特点是粒径小，表面积大，毒素吸收能力强[3-5]。作为国际公认的致癌物PM2.5，其携带的多环芳烃和硝基化合物(如硝基-多环芳烃、3-硝基苯并蒽酮)被认为是主要致癌化合物[6]。当细胞的DNA损伤后会导致细胞的癌变，细胞DNA修复不及时、不充分或修复错误而进入细胞周期，可发生DNA加合物形成、DNA单链断裂、DNA双链断裂、碱基错配、脱碱基位点、碱基的插入或缺失等DNA损伤表现。有研究表明PM2.5可造成肺泡II型上皮细胞DNA损伤[7]，PM2.5暴露可引起ROS的产生和DNA损伤，影响胎儿的组织器官形成，导致不良妊娠结局的发生[8]。为了深入探讨PM2.5对DNA造成的损伤及其修复机制，本文以人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，HBE)为实验对象，采用单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)检测PM2.5致HBE细胞DNA损伤情况，荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)检测PM2.5对HBE细胞DNA损伤修复基因mRNA表达影响，蛋白质印迹法(Western blot)检测DNA损伤修复基因的蛋白表达变化，为进一步研究PM2.5对DNA氧化损伤和DNA损伤修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HBE细胞购于中国上海细胞库，PM2.5样品来源山西太原，K2CrO4购于Sigma公司，胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA购于美国Gibco公司，DMEM培养基购于Hyclone公司，SYBR PremixExTaq、PrimeScript RT reagent Kit和RNeasy Mini Kit购于日本TaKaRa公司，hOGG1、hMTH1基因PCR引物由上海生工合成，hOGG1(ab124741)和hMTH1(ab-200832)抗体购于英国Abcam公司，二抗抗体(羊抗兔IgG-HRP)购于美国Thermo Scientific公司。单细胞凝胶电泳所需细胞裂解液、电泳缓冲液及中和液所需试剂，购于上海生工公司；正常融点琼脂糖和低熔点琼脂糖，购于美国BBI公司。倒置荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳系统，为美国BIO-RAD公司产品。

1.2 PM2.5采集和样品处理

实验用武汉天虹TH150F中流量采样器和80 mm直径的石英滤膜，按100 L/min的流量连续采样，每天采样24 h，由于山西太原是我国雾霾严重城市之一，所以PM2.5采样地点在山西省太原市山西大学校园内，采集时间为2018年12月。将吸附有PM2.5颗粒的石英滤膜剪成4小块放入装有超纯水的烧杯中，用锡纸包住口，超声振荡30 min洗脱PM2.5颗粒物，冷却至室温后放入-80℃冰箱。然后将样品洗脱液真空冷冻干燥24 h后照紫外1 h，加入无菌水制备成PM2.5样品储备液，高压灭菌后可用于细胞实验，使用前震荡混匀。

1.3 细胞培养与染毒处理

HBE细胞培养于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中，待细胞铺满培养瓶底面积的70%～80%左右，将培养的细胞消化下来进行计数，调节悬液浓度，然后以5×105/mL的浓度接种到6孔板，每孔加2 mL DMEM完全培养基，待细胞铺满瓶底面积80%左右进行PM2.5水溶液染毒处理。根据课题组前期进行的细胞毒性实验结果，确定单细胞凝胶电泳实验使用PM2.5水溶液浓度分别是0(阴性对照组)、8、20、50 μg/mL，染毒24 h。DNA损伤修复基因表达水平的检测，采用PM2.5水溶液的终浓度分别为0、10和50 μg/mL，染毒24 h，以10 μmol/L的K2CrO4(以下用Cr6+表示)水溶液为阳性对照组。

1.4 单细胞凝胶电泳检测HBE细胞DNA损伤

使用上述方法将细胞培养与染毒后，预冷PBS洗2次，消化细胞，室温3 000 r/min离心5 min，200 μL PBS重悬细胞。第1层胶用0.75%正常熔点琼脂糖150 μL铺于磨砂载玻片上，室温下固化10 min；将20 μL细胞悬液与80 μL质量分数为0.6%的低熔点琼脂糖充分混匀，迅速铺第2层胶，4℃凝固约20 min，去掉盖玻片，将载玻片浸入新鲜的冷细胞裂解液中，4℃静置2 h。放入碱性电泳液中平衡20 min，然后在恒压25 V、300 mA的条件下电泳25 min。取出玻片至中和液中和3次，每次5 min，晾干，碘化丙啶避光染色20 min。在荧光显微镜下，每片随机观察计数100个细胞并拍照，用彗星图像分析软件进行分析，以尾部DNA百分率和尾长作为综合指标进行评价。

1.5 PCR引物设计与合成

在Genbank上找到目的基因mRNA序列，用软件选取CDS两端的序列进行分析，按照引物设计的原则确定qPCR上下游引物，目的基因荧光定量PCR引物见表1。委托上海生工公司按照表1合成qPCR上下游引物。

1.6 荧光定量PCR测定DNA损伤修复基因的mRNA表达水平

提取HBE细胞总RNA并反转录合成cDNA，荧光定量PCR反应按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书步骤操作。各基因PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列见表2。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，55℃退火延伸30 s，共40个循环。以GAPDH的CT值为内参，目的基因CT值采用 2-ΔΔCT

表1 目的基因荧光定量PCR引物

计算后的比值即为各基因的相对表达水平，此步骤由ABI7900HT分析软件自动计算并直接给出结果。

1.7 Western blot检测DNA损伤修复基因的蛋白表达水平

细胞染毒结束后，倒弃细胞培养液，用冷PBS清洗3次，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，100℃变性8 min；用BCA法进行蛋白定量。配制10%分离胶，5%浓缩胶，依次加入蛋白样品；浓缩胶于80 V条件下电泳30 min，分离胶于120 V条件下电泳50 min。SDS-PAGE凝胶电泳结束后，按0.8 mA/cm2胶面积设定转膜电流，恒流转膜100 min，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h。根据各目的蛋白相对分子质量大小，切取膜上相应条带，按抗体说明书上的比例加入相应的一抗后冰上孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。按1∶3 000比例稀释HPR标记的羊抗兔二抗，室温下孵育1 h；TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入ECL化学发光试剂后用冷CCD成像系统对其进行曝光拍照，所得图像用Image J软件进行条带灰度定量分析。

1.8 统计分析

实验数据以均值±标准差(xˉ±s)表示，所有实验重复3次；应用SPSS 24.0软件进行统计学分析，对照组和PM2.5水溶液染毒组各指标间差异的分析采用单因素方差分析进行多组间比较，LSD法进行两两比较，以α=0.05为检测水准。

2 结果

2.1 PM2.5水溶液染毒后HBE细胞DNA损伤情况

SCGE检测细胞DNA损伤情况见图1～4，随着PM2.5水溶液浓度的增加，HBE细胞DNA损伤程度逐渐加重，8.0 μg/mL组细胞DNA尾部DNA含量、尾长、尾距与阴性对照组相比，差异无统计学意义；20和50 μg/mL组细胞DNA百分含量、尾长、尾距与阴性对照组相比显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

图1 荧光显微镜观察PM2.5水溶液染毒后细胞DNA损伤的彗星图像

图2 PM2.5水溶液染毒细胞后SCGE检测细胞尾部DNA含量

图3 PM2.5水溶液染毒细胞后SCGE检测细胞尾长

图4 PM2.5水溶液染毒细胞后SCGE检测细胞尾距

2.2 PM2.5水溶液染毒后HBE细胞DNA损伤修复基因mRNA表达水平变化

qPCR检测结果见图5和图6，与阴性对照组比较，hOGG1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及阳性对照Cr6+染毒后表达水平分别升高75.0%、132.0%、214.0%，hMTH1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+水溶液染毒后表达水平分别升高61.0%、144.0%、75.0%，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

图5 PM2.5对HBE细胞hOGG1 mRNA表达水平的影响

图6 PM2.5对HBE细胞hMTH1 mRNA表达水平的影响

2.3 PM2.5水溶液染毒后HBE细胞hOGG1和hMTH1蛋白表达水平变化

Western blot结果见图7，与阴性对照组比较，hOGG1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒和Cr6+染毒后表达水平分别升高47.6%、64.0%、47.0%，hMTH1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+染毒后表达水平分别升高20.5%、49.8%、20.9%，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

图7 PM2.5染毒对HBE细胞hOGG1和hMTH1蛋白表达水平的影响

3 讨论

本研究中，应用单细胞凝胶电泳实验检测DNA损伤情况，表明PM2.5水溶液中剂量组20 μg/mL和高剂量组50 μg/mL对细胞DNA含量、尾长、尾距有明显影响，与阴性对照组比较显著升高；进一步用10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒HBE细胞，检测DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1的mRNA和蛋白表达量的变化，结果显示10和50 μg/mL PM2.5水溶液均引起HBE细胞中hOGG1和hMTH1 mRNA和蛋白表达水平均显著高于阴性对照组；差异有显著的统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。这些结果提示，PM2.5对人支气管上皮细胞DNA具有明显的损伤作用。

大量的流行病学研究表明，空气污染对人体健康存在严重危害[9-10]。DNA作为机体的主要遗传物质，其稳定性对机体的作用至关重要，PM2.5中的各种有害物质进入循环系统后，在体内产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS诱导氧化应激和DNA损伤，可导致DNA双链断链[11]。可产生不同程度的致畸、致癌、致突变遗传毒性，增加罹患恶性肿瘤的风险以及畸胎的发病率[12]。由于PM2.5通过人体呼吸首先进入肺部，对呼吸系统影响毋庸置疑，所以本文选取的人支气管上皮细胞HBE，HBE是永生化人支气管细胞系[13]，仍保持人支气管上皮细胞及非致瘤性特征。

鸟嘌呤的氧化还原电位较低，因此最易受到ROS的攻击形成8-氧鸟嘌呤(8-oxo G)及8-氧脱氧鸟苷三磷酸(8-oxo-d GTP)，8-oxo-dG是一种主要的DNA氧化损伤产物，可在DNA复制中通过G→T或A→C碱基颠换导致DNA误读。8-oxo-d GTP在复制过程中可插入到DNA链中与碱基反应形成8-oxo G。如果未及时处理8-oxo G，就会在DNA复制过程中造成G：C→T：A颠倒突变。人8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)及MutT同源酶即人8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶(hMTH1)是机体内修复8-oxo G的主要工具酶。hMTH1主要负责核苷酸池中8-OH-GTP的清除，hOGG1主要负责DNA中对8-oxo-dG的修复，防止G：C→T：A颠倒突变，其共同作用与DNA损伤修复关系密切，能有效地检测并定量分析细胞中DNA单双链缺口损伤的程度，所以本文选择检测这两个基因的表达水平。单细胞凝胶电泳实验是经典的检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术[14]，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该方法检测低浓度遗传毒性具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期，同时这种技术需要的细胞数较少[15]。

鉴于目前大气污染与肺癌发病存在密切关系，为了深入研究环境污染物致癌的分子毒理学机制，本文采用PM2.5染毒HBE细胞，研究PM2.5对DNA损伤修复基因表达的影响，探讨PM2.5对细胞DNA损伤作用，对于今后进一步研究环境污染物和雾霾的健康危害，具有一定的理论意义和实际应用价值。