甲基丙烯酸环氧丙酯的遗传毒性评价

王全凯，谢广云，马顺鹏 ，郭浩然，乌瀚宝栎尔，宋佳阳，许建宁，*

(1.中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050；2.江阴市疾病预防控制中心，江苏 无锡 214434；3.中国疾病预防控制中心化学污染与健康安全重点实验室，北京 100050)

甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又称甲基丙烯酸缩水甘油酯，作为聚合反应单体的一种，在食品包装材料的内表面涂层有广泛应用；同时，还是牙科治疗材料中树脂和粘合剂的重要组分[1-2]。研究表明，GMA属于低毒类化学物质，具有明显的刺激性，可引发豚鼠皮肤的速发型和迟发型变态反应，多项致突变试验结果阳性，长期暴露存在生殖发育毒性，也具有潜在致癌性[3]。目前，对其遗传毒性的系统评价仍缺少足够的实验室证据，毒性机制有待进一步阐明。

体外哺乳动物细胞微核试验是评价化学物质遗传毒性的主要手段。在不同剂量受试物暴露的条件下，通过观察分裂间期细胞的微核形成数量，来反映细胞染色体断裂和非整倍体作用的活性改变，基于此评价受试物的遗传毒性[4-5]。本研究以中国仓鼠肺细胞(V79)为对象，对不同剂量GMA诱发其细胞的微核发生率进行评价，为进一步研究GMA的毒性作用机制提供证据支持。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂

甲基丙烯酸环氧丙酯，购于美国Sigma公司，CAS号106-91-2，分子式C7H10O3，熔点＜-50℃，沸点189℃，密度1.042 g/mL(25℃)。MEM培养基购于美国Life Technologies公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于美国Gibco公司；细胞松弛素B、Giemsa染料、丝裂霉素C和环磷酰胺均购于美国Sigma公司；双抗(青链霉素混合液)购于北京Solarbio公司。

CO2培养箱购于美国Thermo公司；超净工作台购于北京东联哈尔仪器制造有限公司；台式高速离心机购于BECKMAN公司；倒置显微镜购于日本Olympus公司；生物显微镜购于日本Nikon公司。中国仓鼠肺细胞(V79)，购于中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养液氮冻存的V79细胞复苏后，加入含10%FBS的MEM培养液，置37℃、CO2体积分数为5%的C02培养箱中培养。待细胞长满85%瓶底面积左右，加入0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3进行传代，接种于25 cm2细胞培养瓶中继续培养。期间观察、记录各瓶细胞生长及形态变化。取对数生长期的V79细胞用于实验。

1.2.2 细胞毒性实验本课题组通过预实验确定GMA对V79细胞的绝对致死浓度(LC100)70 μg/mL，因此选择终浓度 20、30、40、50、60 和 70 μg/mL 的GMA进行染毒处理，每个浓度组设3个平行样，同时设DMSO溶剂对照；置培养箱中24 h后，0.25%胰酶消化收集细胞制成单细胞悬液，经过台盼蓝染色后，使用计数板分别计数活细胞和死细胞数量，每个浓度组重复计数3次，计算细胞存活率。

细胞存活率/%=同一浓度组活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%

相对存活率/%=同一浓度组的平均活细胞数/DMSO溶剂对照组平均存活细胞数×100%

1.2.3 V79细胞的体外微核实验及评价使用浓度分别为2.25、4.5、9.0、18.0、36.0 μg/mL的GMA染毒V79细胞，设置空白对照组、DMSO对照组和阳性对照组。3 h处理组分别在加和不加体外活化系统(S9)条件下开展微核试验评价，24 h处理组只在不加S9条件下进行。无S9条件下，0.5 μg/mL的丝裂霉素C作为阳性对照；有S9条件下，5 μg/mL的环磷酰胺为阳性对照。GMA染毒V79细胞3 h后，更换新的MEM培养液和终浓度为5 μg/mL的细胞松弛素B(cyto B)，继续培养至24 h收获细胞。GMA接触V79细胞24 h处理组，染毒结束后收获细胞。

体外微核试验采用经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)发布的《体外哺乳动物细胞微核试验方法及评价标准》(No.487)[6]。细胞培养至24 h后收获细胞，加入0.075 mol/L KCI溶液5 mL，使用固定液(V甲醇∶V冰醋酸=4∶1)反复固定，最后使用Giemsa染液进行染色。在光学显微镜下(×40)观察，要求每个剂量组观察不少于2 000个双核细胞，并记录含有微核的双核细胞数，计算微核细胞率；此外，至少观察500个细胞，通过计算复制指数，评价V79细胞的增殖情况。

微核细胞率/‰=观察到含微核的细胞数/观察的总双核细胞数×1 000‰

复制指数/%=双核细胞数/(双核细胞数+单核细胞数)×100%。

1.3 统计学方法

采用SAS9.0统计软件进行数据分析，细胞复制指数和双核细胞微核率的比较采用卡方检验，线性回归模型用来分析浓度和效应的相关性。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GMA对V79细胞的毒性作用

细胞毒性试验的结果如表1所示，随着染毒剂量的增加，V79细胞的存活率降低，呈浓度-效应关系(R2=0.892，P＜0.01)。经计算，GMA半数致死浓度(LC50)为35.2 μg/mL。根据细胞毒性实验结果，选用2.25～36.0 μg/mL剂量范围作为V79细胞微核试验的染毒剂量。

表1 GMA对V79细胞的毒性作用

2.2 GMA对V79细胞复制指数的影响

GMA染毒的不同剂量组的细胞复制指数结果见表2，在加与不加S9条件下，各染毒剂量组复制指数的变化均在正常范围之内，未见GMA对V79细胞复制指数产生明显影响。

2.3 GMA对V79细胞微核率的影响

图1为V79细胞染色固定后的显微镜下图，GMA染毒剂量在2.25～36.0 μg/mL范围内，V79细胞微核率的结果见表3。在无S9条件下，与DMSO溶剂对照组相比，随着GMA染毒浓度的增加，3和24 h组的V79细胞微核率均逐渐升高，呈明显的浓度-效应关系(3 h 染 毒 组R2=0.967，P＜0.01；24 h 染 毒 组R2=0.959，P＜0.01)，其中在 9.0、18.0、36.0 μg/mL 浓度组的微核细胞率的差异有统计学意义(P＜0.05)。有S9条件下，与对照组相比，各剂量组GMA接触3 h的微核细胞率的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 GMA染毒V79细胞复制指数结果

图1 显微镜下观察V79细胞染色固定后的双核细胞(×40)

3 讨论

甲基丙烯酸环氧丙酯作为双官能团单体的一种，具有环氧基团的亲电性、双键烷化的特性，提示GMA可能会对细胞造成氧化性损伤或直接作用于DNA，造成染色体损伤[7]。虽然美国食品药品监督管理局(FDA)将其列为可与食品接触的材料，但目前对于人群每日的潜在接触和摄入程度尚不清楚。随着GMA在食品包装材料及医疗材料领域的广泛应用，GMA的职业暴露和消费者接触摄入对人类健康的影响越来越引发人们的关注[2]。

受试物的非整倍体剂和断裂剂效应是诱发染色体潜在损伤的基础，而体外哺乳动物细胞微核试验能够同时检测到这两种诱发效应。当微核来源于滞后的整条染色体时，运用本方法的检测分析比传统的染色体畸变试验更为有效[9]，OECD将其作为非整倍体剂和染色体断裂剂诱发效应的标准替代方法。越来越多的研究表明，无论是在用或不用细胞松弛素B处理的情况下，在CHO、V79、CHL/IU和L5178Y等啮齿类细胞株以及人淋巴细胞进行试验都是非常有效的[10-11]。在国际遗传毒性技术科学委员会开展的合作研究和国际遗传毒性试验工作组的报告框架中，体外哺乳动物细胞微核试验结果也是必不可少的内容。

在本研究中，选择2.25～36.0 μg/mL的GMA染毒剂量范围处理V79细胞，对GMA诱发V79细胞的遗传毒性进行评价。在加或不加S9条件下，各染毒剂量组均未见GMA对V79细胞复制指数产生明显影响，这表明在此浓度范围内，GMA对V79细胞的增殖无影响。在无S9条件下，与对照组相比，染毒3和24 h处理组的V79细胞的微核率均逐渐升高，并呈明显的浓度-效应关系，其中高浓度组V79细胞的微核率差异有统计学意义，提示GMA可以诱发V79细胞的染色体或纺锤体损伤，这与课题组早期的GMA致突变研究有良好的相关性[12]。在加S9条件下，染毒3 h的高剂量组微核细胞率与对照组相比，两者的差异无统计学意义。由于缺乏体内代谢活化系统是影响体外微核试验结果的因素之一，只有经代谢活化后，化学物质的毒性检测才尽可能接近人体真实接触的毒作用情况[6]。而在体内微核试验的研究中，发现经口染毒只有在高剂量组骨髓细胞微核率升高，在腹腔注射染毒的微核试验研究中，未发现细胞微核数量存在剂量-反应关系[13]。

综上所述，在本实验室条件下，GMA浓度在2.25～36.0 μg/mL范围内，可致V79细胞的微核率升高，表明GMA可诱发遗传物质损伤，具有遗传毒性。