功能性红曲菌丝体的液态发酵制取方法

杨晓暾

(佛山市真红生物制品有限公司，广东佛山 528244)

真菌多糖在国内外医学界称之为免疫调节剂。红曲菌丝体是利用微生物红曲菌进行液态发酵、大规模生产最成功的天然微生物之一。多糖红曲菌丝体蛋白质含量非常丰富（含量为干重的36%以上），脂肪含量较低，具有高营养、低热量的特点。同时，多糖红曲菌丝体含有一定量的水溶性多糖，通过共价键与蛋白质构成蛋白聚糖发挥生物学功能，识别外来组织的细胞等；多糖类物质在抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗氧化、抗感染、降血糖血脂和抗辐射、抗衰老中都表现出生物活性；在抗艾滋（AIDS）和抗肿瘤等难治性疾病研究中具有潜在的治疗价值。因此，多糖红曲菌丝体在不久的将来会成为众人喜爱的健康食材。

因1995年法国学者P.J.Blanc等在红曲菌发酵产物中检测到一种对人畜有害的真菌毒素桔霉素(Citrinin)，使红曲菌产品在世界范围内应用受到限制，P.J.Blanc认为，桔霉素的产生与红曲菌次生代谢产物的代谢偏高有关[2]。红曲桔霉素含量的控制已被各生产企业定为攻关目标。其代谢途径与红曲菌培养方式及培养基组成密切相关，同一菌株不同条件下可能产或不产桔霉素，不同条件下产桔霉素差异的形成可能与外界因素诱导基因组产生差异表达有关。日本厚生省在1999年颁布、2003年修订的《日本食品添加剂标准》中对红曲色素的桔霉素含量做了限定，日本限量指标定为0.2 mg/kg（色价基准为5 u/g，1%），韩国食品和功能性食品限量为0.05 mg/kg。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：诱变菌株丛毛红曲菌(Monascus pilosusZheng YZ101)。

试剂及耗材：马铃薯、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂，磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸钠，一切皆可食用的大米粉（除了农残和重金属超标）。

仪器设备：水浴锅、752分光光度计、pH酸度计、酒度计、电子台秤、高压锅、超净台、生化培养箱、烘箱、种子罐、发酵罐、烘干机、粉碎机等。

1.2 实验方法[1]

1.2.1 培养基及方法

1.2.1.1 培养基

分离培养基PDA：20%马铃薯1000 mL，葡萄糖20 g，琼脂20 g。

分离培养基CYA：蔗糖3%，酵母膏5.0%，磷酸二氢钾0.1%，硝酸钠3%，硫酸镁0.05%，蒸馏水1000 mL，1.5%琼脂。

KMA：可溶性淀粉3%，麦芽糖3%，蛋白胨2%，琼脂2%。

1.2.1.2 菌种选育

将已培养好的试管斜面种，接入装有30～50 mL无菌水的三角瓶，置于摇床振荡30～40 mL过滤，取10 mL孢子悬浮液，加到Φ9 mL的带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射（2～10 min），涂平板（用黑布包扎），于温度32～35℃下培养6～8 d。

1.2.2 选育步骤[1]

(1)利用原生产菌种为母种，经紫外诱变处理后接于平板培养基进行分离培养，温度32～35℃培养6～8 d，在培养过程中不定期观察其生长变化情况，挑选有代表性的菌落接入试管斜面培养6～8 d。

(2)用已培养成熟的菌株作摇瓶跟踪试验，淘汰生长慢、发酵水平低的菌株，筛选生长快、高产多糖、蛋白具有代表性的分离种，再次进行培养基配方试验。

A.斜面培养基：取麦芽汁10～20 Be作为通用培养基，煮沸，按重量比分别按40%～70%的量装入试管或茄子瓶，灭菌，冷却,接种，培养6～8 d。

B.斜面特制培养基：取按照重量百分比计算的可溶性淀粉8%～15%，硝酸钠0.1%～0.3%，麦芽糖1%～5%，蛋白胨0.1%～0.5%，琼脂2%～3%与水进行混合，煮沸，与步骤1中培养的斜面培养基,分别按重量比40%～70%的量装入试管或茄子瓶，灭菌，冷却，接种培养6～8 d。

C.液态摇瓶培养基：选取淀粉8%～15%、硝酸钠0.1%～0.3%、酵母膏0.1%～0.5%、玉米浆0.2%～0.5%与水进行混合、搅拌均匀，再用乳酸调节pH值为3.0～5.0，煮沸，形成液态摇瓶培养基，分别按重量40%～70%的量装入三角瓶，灭菌，冷却、接种摇瓶培养20～30 h。

1.2.3 摇瓶试验

以米粉为碳源，玉米浆为有机氮源、NaNO30.2%～0.5%为无机氮源，称重发酵液菌丝体收得率。

摇瓶配方①：米粉6%～8%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米浆0.2%～0.3%，NaNO30.2%～0.5%，称重发酵液菌丝体收得率，用乳酸调节初始pH3.5。

摇瓶配方②：米粉10%～12%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米浆0.2%～0.5%，称重发酵液菌丝体收得率，用乳酸调节初始pH3.5。

摇瓶配方③：米粉13%～15%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米浆0.2%～0.5%，称重发酵液菌丝体收得率，用乳酸调节初始pH3.5。

1.3 分析方法[4]

菌丝体粗蛋白的测定：凯氏定氮法GB/T 5009.5—2003。

菌丝体粗多糖的测定：水提醇沉法提取，直接干燥法测定。

精确称取100目样品10 g，放入250 mL三角瓶中加入300 mL蒸馏水（固液比1∶30），于90℃水浴中提取2 h，间隔振荡几次，取出后于3000 r/min，离心5 min去除菌体。将上清液减压浓缩至50 mL（原体积的1/6），边搅拌边加入200 mL（4倍体积）乙醇，4℃沉淀10 h。将混合物移至离心管中3000 r/min，离心15 min，弃去上清液，沉淀（即粗多糖）于60℃干燥至恒重，称重。

1.4 桔霉素的测定方法

检测依据：保健食品检验与评价技术规范，中国卫生部2003年版。

样品经TEF（固态样）、乙醇（液态样品）3次萃取后，微滤后直接进样分析。

高效液相色谱仪及色谱条件：

仪器：HP1100；检测器：荧光检测器；(λex=331,λem=500)。

进样量：5μL；温度：28℃；流速：1 mL/min。

桔霉素含量计算公式：

其中：D：稀释倍数；S2：样品峰面积；S1：标样峰面积；C1：标样浓度（mg/L）。

2 结果与分析

2.1 培养温度对发酵速度的影响（图1）

图1 培养温度对发酵速度的影响

由图1可知，红曲液态发酵随着温度的升高而加快，当温度在28～35℃时，红曲菌是最适生长温度，菌丝体繁殖很快，37～40℃达到最高峰，超过40℃就会减缓其发酵速度至衰老。红曲菌的生长对温度较敏感，过高或过低都能明显地影响其生长繁殖速度。在适宜的温度范围下，红曲菌繁殖代谢旺盛，温度过高或过低，都会直接影响其生长速度。

2.2 发酵时间对产生菌丝体的影响（图2）

由图2可知，红曲菌液态发酵随着时间的延长，发酵液开始变稠，菌丝体就不断地增多。在一定的浓度比、通风比及最适生长温度为（28～35℃）条件下，红曲菌生长繁殖最快，发酵菌丝体随着时间的延长而增多，在75～80 h达到最高，随着发酵时间不断延长，繁殖速度会减缓甚至死亡[3]。我们要控制好发酵工艺条件，及时分析检测发酵液pH值、残糖，在菌丝体最高浓度、最佳时间终止发酵。

图2 发酵时间对产生菌丝体的影响

2.3 摇瓶试验（表1）

分别对以上3种配方进行摇瓶分析检测，所生产的红曲菌丝体产品进行多糖、蛋白、桔霉素、洛伐他汀分析检测，基本上未检出桔霉素、洛伐他汀。经多次试验跟踪表明，经过紫外育种分离筛选的菌种，通过严格、特定的工艺控制，在既不产桔霉素和洛伐他汀同时，还可以高产红曲多糖和红曲蛋白含量。

2.4 发酵罐生产工艺[5]（30 m3）

采用工艺流程：米粉——定容（22.0 m3）——灭菌（0.1～0.15 MPa、30 min）——冷却降温（30～35℃）——接种（5%～10%）——发酵培养(65～80 h）——板框压滤——菌丝体烘干（60～80℃）——粉碎过筛(100～200目)——产品包装（多糖红曲菌丝体）

发酵处理：将米粉发酵培养基按照重量百分比8%～15%、玉米浆0.2%～0.5%与水进行混合，搅拌均匀后泵入生产发酵罐，加入自来水至罐体有效体积的60%～80%，用乳酸调节pH值为3.0～5.0，高温灭菌后冷却至常温，将上述生产的液态摇瓶种接入发酵液培养基，进行液态发酵培养，使菌株生长出红曲菌丝体；高温灭菌时间为30～40 min，温度为121～125℃，压力为0.1～0.15 MPa。

液态发酵培养条件为：温度为30～35℃，通风比为1∶0.～0.6；发酵罐内压力为0.03～0.06 MPa，时间为65～80 h。

表1 摇瓶发酵实验结果

发酵后处理：将已培养好的红曲菌丝体，经过压榨、膜过滤后，分离出固体部分和液体部分。

收集菌丝体：将分离出的固体部分，即红曲菌丝体，在温度40～100℃下经真空干燥、粉碎，得到功能性红曲菌丝体粉末。

液态发酵制取功能性红曲菌丝体的原料，不限于大米，也可以是谷类淀粉原料，如大麦、小麦、燕麦、荞麦、玉米中的一种或几种混合物制得的淀粉。

2.5 多糖红曲深层发酵生产工艺条件控制

2.5.1 浓度比

除了摸索红曲菌合适的发酵生产配方外，碳、氮比，料液浓度比也是高产菌丝体、低产或不产桔霉素最基本保证，一般控制碳、氮比8∶1.5较为合适；pH4.0～6.5条件下对红曲菌生长有利。

2.5.2 温度[6]

红曲菌的最适生长温度为32～35℃，从节能降耗考虑，相对提高红曲菌发酵生产温度，缩短发酵时间（65～80 h），便于生产控制。在筛选菌种时，我们对红曲菌进行了特殊处理（如耐高温、耐酸及耐高压、嗜乙醇等），使筛选获得的菌种具有性能稳定和培养粗放的特点；相对升高红曲菌发酵生长温度(35～37℃)，不但可以节能降耗，而且还能提高发酵水平（即菌丝体收得率）、降低桔霉素产生[3]。

2.5.3 通风比

红曲菌属于耗氧型微生物，在发酵生产过程中需要一定的通风量，通风量大小直接影响红曲菌生产过程中速度的快慢，对红曲菌发酵繁殖代谢产生大量菌丝体，从而提高红曲多糖和红曲蛋白；通过发酵时间、发酵温度的控制，可以不产洛伐他汀和桔霉素。如何保证红曲菌生长旺盛期代谢力强、需氧量较大而不产桔霉素[6]，我们采取了降低发酵液的浓度比，使液体流动性增大，从而相对增加通风量的同时可以降低溶解氧，因此而降低桔霉素的产量，通风比值在1∶0.5～0.8较好。由于控制深层发酵过程中通风量在不同时期有不同要求，应根据具体发酵罐体积、浓度比等条件而定。

经过多批次生产验证，将所得多糖红曲菌丝体分别抽样送华南理工大学、广东省微生物所等国内权威检测机构分析检测，其检测结果基本一致。

2.5.4 多糖红曲样品中桔霉素含量的测定结果

从表1中检测结果可以看出，红曲菌丝体中的红曲多糖和红曲蛋白含量高，桔霉素和洛伐他汀含量未检测出来，符合日韩最低限量标准。说明通过对红曲菌的改造选育，在一定的工艺条件下，完全可以控制多糖红曲产品中的桔霉素含量从而保证产品质量。

3 结论

液态发酵多糖红曲菌丝体含有非常丰富的营养成分，蛋白质占36%，多糖5%～7%，脂肪3%左右，其中不饱和脂肪酸含量占总脂肪的70%，必需的脂肪酸占30%以上，并且富含多种微量元素，安全无毒，具有一定的降血脂、降糖功效，可以开发其红曲菌丝体为保健功能食品[4]。

随着大健康事业的发展，食疗胜过医疗的理念会越来越被人们接受，药食同源的多糖红曲的应用会越来越广泛。我们将继续进行更加细致、深入的研究，使液体深层发酵多糖红曲菌丝体工艺不断完善和改进，有效地控制桔霉素和洛伐他汀的产生，把多糖红曲产品质量进一步稳定和提高，使中国千年瑰宝多糖红曲真正走向世界、造福人类。