MicroRNA-124对喉鳞状细胞癌细胞自噬、侵袭和迁移的影响

鲁保才，李 靖，郜庆祖，余文发，卢振民，连 荣，苏 蔚

(1.新乡医学院第一附属医院耳鼻喉科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院病理科，河南 卫辉 453100)

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是一种高侵袭性头颈部恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%～5%，已成为呼吸道第2位高发恶性肿瘤[1-2]。随着诊疗技术的进步，LSCC的治疗效果得到了明显改善，但患者的预后仍不佳，5 a生存率较低。相关研究表明，人体细胞自噬是维持机体正常生理平衡和内环境稳态的重要机制，与生长发育及肿瘤发生等过程密切相关[3]；自噬调节紊乱是人LSCC发生、发展的重要影响因素[4]。微RNA(microRNA,miRNA)是一类参与多种细胞生理过程的内源性非编码RNA，能够调节数百个靶基因的表达，在细胞生长、增殖、分化和凋亡中发挥不可缺少的作用，但miRNA在人恶性肿瘤中的表达存在显著差异。miR-124是miRNA家族的一员，广泛参与前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移[5-8]；然而，miR-124在人LSCC中的表达特点和作用尚不明确。本研究旨在探讨miR-124在人LSCC组织中的表达及其对LSCC细胞自噬、侵袭和迁移的影响，以期为LSCC的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016 年1 月至2018 年9 月新乡医学院第一附属医院耳鼻咽喉科收治的LSCC患者手术切除的癌组织及其匹配的癌旁组织(距肿瘤边缘1～2 cm)标本为观察对象，所有标本手术切除后立即放入液氮保存。纳入标准：患者术前未接受放射治疗、化学治疗，均经病理学检查确诊为LSCC。排除标准：(1)妊娠期妇女；(2)有严重心脑血管疾病者；(3)有重要脏器功能障碍和感染者。本研究共纳入LSCC患者12例，男6例，女6 例，年龄33 ～ 57(44.3±8.2)岁。本研究经医院伦理委员会审核批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验细胞人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2购自南京科佰生物科技有限公司，液氮冷冻保存。

1.3 主要试剂与仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自加拿大Gibco公司，无血清Opti培养基购自美国Hyclone 公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TRIzol裂解液购自日本TaKaRa公司，miRNA反转录试剂盒、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒购自广州天骏生物科技有限公司，基质胶、细胞培养板购自美国Corning 公司，Transwell小室试剂盒购自美国 Novus Biologicals 公司，吉姆萨染色剂购自上海歌凡生物科技有限公司，细胞裂解液购自北京百泰克生物技术有限公司，显色液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，微管相关蛋白轻链3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B)抗体、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自美国Abcam公司，转染脂质体 2000(lipofectamine 2000)购自上海英潍捷基贸易有限公司，西罗莫司购自上海麦克林生化科技有限公司，3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine autophagy inhibitor,3-MA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，miR-124 类似物(miR-124 mimics)、miR-124抑制剂(miR-124 inhibitor)、类似物阴性对照(mimics negative control,mimics NC)和抑制剂阴性对照(inhibitor negative control,inhibitor NC)序列均由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成；核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、酶标仪均购自美国 Thermo 公司，凝胶成像仪购自英国Cleaver公司，PCR仪购自深圳市瑞安康科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测LSCC组织和癌旁组织中miR-124表达取LSCC组织和癌旁组织各100 mg放入瓷研钵中，加入液氮研磨，迅速使用液氮预冷的金属勺将组织样本转移至液氮预冷的EP管中，加入1 mL TRIzol试剂，提取RNA，使用核酸蛋白分析仪检测RNA浓度；对RNA进行反转录，反转录条件为37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。将反转录得到的cDNA用于qRT-PCR检测，以人U6为内参，miR-124正向引物序列为5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反应体系：2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL，All-in-OneTMmiRNA qPCR Primer 2 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，cDNA溶液 2 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，RNase Free dH2O 3.8 μL。实验操作根据miRNA PCR试剂盒说明书进行，PCR反应条件： 95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。应用2-△△Ct法计算miR-124的相对表达量。每个样本重复3次，取均值。

1.4.2 细胞培养、分组及处理将人Hep-2细胞置于2 mL含有体积分数10% FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)中，于37 ℃、含体积分数5% CO2的细胞孵箱中培养，细胞融合度达80%以上时，胰蛋白酶消化，传代培养，待细胞融合度达50%～60%时，根据处理条件分为miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组。miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组及inhibitor NC组细胞的DMEM培养基更换为1.5 mL Opti培养基；mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的DMEM培养基更换为1.5 mL Opti培养基，mimics+西罗莫司组细胞加入200 mmol·L-1的西罗莫司2 μL，inhibitor+3-MA组细胞加入10 g·L-1的3-MA 2 μL；然后，吸取5 μL miR-124 mimics、miR-124 inhibitor、mimics NC、inhibitor NC加入装有 250 μL Opti培养基的无菌EP管中，吸取5 μL 转染脂质体2000加入到另外装有250 μL Opti培养基的无菌EP管中，吹打混匀，室温静置5 min后将以上2管液体混匀，室温静置20 min。然后将混合液加入到已加有1.5 mL Opti培养基的各组细胞中，轻柔混匀。置于37 ℃、含体积分数5% CO2的细胞孵箱中培养4～6 h，将孔中的液体换成2 mL含体积分数10% FBS的DMEM培养基，继续培养，2 d后收集细胞用于后续实验。

1.4.3 qRT-PCR法检测过表达及干扰表达miR-124的细胞中miR-124的表达将转染2 d后的miR-124 mimics组、mimics NC组、miR-124 inhibitor组、inhibitor NC组细胞用PBS洗3次，吸干PBS后加入1 mL TRIzol，常温裂解5 min，提取RNA。按照“1.4.1项”方法进行反转录和miRNA qRT-PCR检测。

1.4.4 Western blot 法检测LSCC组织、癌旁组织和Hep-2细胞和癌旁组织中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ的表达取LSCC组织和癌旁组织标本各100 mg，剪碎后置于EP管中，加入0.5 mL 裂解液；取“1.4.2项”培养的miR-124 mimics组、mimics NC组、miR-124 inhibitor组、inhibitor NC组细胞，PBS洗3次，使用细胞刮将细胞刮下并转移至1.5 mL离心管中，4 ℃ 1 000 r·min-1离心3 min，弃上清液，加入0.2 mL裂解液；在冰上对组织和细胞进行超声裂解后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心，吸取上清液并检测浓度。取30 μg蛋白样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，切胶后进行转膜，以脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入LC3B、GAPDH抗体一抗(11 000)孵育，4 ℃过夜后进行洗膜，加入二抗(15 000)，室温孵育1 h后进行洗膜和曝光。

1.4.5 Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力使用无血清DMEM稀释4 ℃过夜融化的基质胶(51)，吸取55 μL稀释液均匀铺于Transwell小室上室底部，将Transwell小室置于37 ℃恒温箱中孵育2 h，然后置于紫外灯下照射30 min。取“1.4.2项”培养好的miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组的细胞，用不含血清的细胞培养液配制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106L-1，吸取200 μL接种于Transwell小室上室底部，下室添加500 μL含体积分数20% FBS的培养基，注意避免产生气泡。将Tranwell小室置于37 ℃恒温孵育箱中，36 h后使用棉签将Transwell小室内壁膜上的细胞轻轻擦去，将小室置于体积分数95%乙醇中固定30 min，用水轻轻漂洗，使用吉姆萨染色剂进行染色，显微镜下观察，视野中出现的有核细胞即为侵袭细胞，随机选取5个视野计数侵袭细胞数目，取均值。

1.4.6 划痕实验检测各组细胞迁移能力取“1.4.2项”培养好的各组细胞。按照每孔6×105个细胞接种于6孔板，待细胞融合度达90%时，在每个孔的底部距离直径0.5 cm处使用200 μL无菌枪头平行划2道直线，分别于0、72、96 h时将培养基换为PBS，然后在显微镜下拍照，测量划痕宽度，计算愈合率，划痕愈合率=[(0 h宽度-测量时宽度)/0 h宽度]×100%。

2 结果

2.1 LSCC组织和癌旁组织中miR-124表达比较LSCC组织和癌旁组织中miR-124相对表达量分别为0.160±0.038、1.237±0.072，LSCC组织中miR-124相对表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 LSCC组织和癌旁组织中自噬蛋白LC3B-Ⅱ表达比较结果见图1。LSCC组织和癌旁组织中LC3B-Ⅱ的相对表达量分别为1.92±0.06、0.91±0.04，LSCC组织中LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 LSCC组织和癌旁组织中自噬蛋白LC3B-Ⅱ的表达

Fig.1 Expression of autophagy-related protein LC3B-Ⅱ in LSCC tissues and paracancerous tissues

2.3 过表达和干扰表达miR-124的细胞中miR-124相对表达量比较miR-124 mimics组、mimics NC组、miR-124 inhibitor组、inhibitor NC组细胞中miR-124相对表达量分别为50.11±4.41、2.37±0.18、0.51±0.07、2.53±0.10。miR-124 mimics组细胞中miR-124相对表达量显著高于mimics NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-124 inhibitor组细胞中miR-124相对表达量显著低于inhibitor NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 过表达和干扰表达miR-124的细胞中自噬蛋白LC3B-Ⅱ表达量比较结果见图2。 mimics NC组、miR-124 mimics组、inhibitor NC组、miR-124 inhibitor组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量分别为0.32±0.02、0.12±0.03、0.21±0.05、2.31±0.09。miR-124 mimics组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著低于mimics NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-124 inhibitor组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著高于inhibitor NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：mimics NC组；2：miR-124 mimics组；3：inhibitor NC组；4：miR-124 inhibitor组。

图2 过表达和干扰表达miR-124的细胞中自噬蛋白LC3B-Ⅱ的表达

Fig.2 Expression of autophagy-related protein LC3B-Ⅱ in miR-124-upregulated and miR-124-downregulated cells

2.5 各组细胞侵袭细胞数比较结果见图3。miR-124 mimics组、mimics NC组、mimics+西罗莫司组、miR-124 inhibitor组、inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组侵袭细胞数分别为22.2±2.1、56.7±5.4、50.3±4.8、111.5±7.3、42.4±2.5和56.3±3.4个。miR-124 mimics组侵袭细胞数显著少于mimics NC组和mimics+西罗莫司组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-124 inhibitor组侵袭细胞数显著多于inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A:mimics NC组；B：miR-124 mimics组；C：mimics+西罗莫司组；D：inhibitor NC组；E：miR-124 inhibitor组；F：inhibitor+3-MA组。

图3 各组细胞侵袭能力

Fig.3 Cell invasion abilities in each group

2.6 各组细胞迁移能力比较培养72 h后，miR-124 inhibitor组、inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率分别为(91.3±1.6)%、(78.2±2.8)%、(75.4±3.9)%；inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率低于miR-124 inhibitor组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养96 h后，miR-124 mimics组、mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率分别为(82.2±2.1)%、(96.2±1.9)%、(94.6±5.7)%；mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率高于miR-124 mimics组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

LSCC的侵袭转移是受多因素调控的过程，是影响患者预后的关键因素。研究显示，miRNA和自噬对LSCC侵袭转移起重要的调控作用[9]，因此，干预LSCC的 miRNA表达和自噬活动为治疗LSCC提供了新思路。

miRNA是一类参与多种细胞过程的内源性非编码RNA，含有18～22个核苷酸，可通过绑定mRNA的3′-UTR端从而下调靶基因的表达[10]。miRNA的表达水平与肿瘤活动密切相关，其调控肿瘤细胞生理、病理过程，发挥致癌或抑癌作用。研究表明，LSCC与miRNA表达密切相关，LSCC组织中异常表达的miRNA可以作为一种生物标志物为判定肿瘤的进展提供重要参考[4,11]。miR-124作为miRNA家族的一员，广泛参与前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移[5-8]，但其在LSCC中的表达特点和作用尚不明确。本研究旨在探究LSCC组织中miR-124表达及其对LSCC侵袭和转移的影响，首先观察了miR-124在LSCC患者癌组织及癌旁组织标本中的表达，结果显示，LSCC组织中miR-124的相对表达量显著低于癌旁组织，提示miR-124在LSCC中发挥抑癌功能。但本研究的样本量较小，尚不足以证明miR-124能够作为预测LSCC预后的标志物。本研究结果显示，miR-124 mimics组细胞中miR-124相对表达量显著高于mimics NC组，miR-124 inhibitor组细胞中miR-124相对表达量显著低于inhibitor NC组，说明相对于mimics NC组，转染miR-124 mimics显著提高人Hep-2细胞中miR-124表达量；而相对于inhibitor NC组，转染miR-124 inhibitor显著降低人Hep-2细胞中miR-124表达量；提示过表达和干扰表达miR-124的细胞模型的转染效率显著，能够用于后续实验。

自噬是广泛存在于真核细胞中的细胞器更新过程，当细胞处于饥饿或受损状态时，细胞内自噬增强并产生自体吞噬，为细胞合成代谢提供必需原料。目前研究发现，自噬与肿瘤的侵袭和迁移关系密切，当肿瘤细胞发生侵袭迁移时，其细胞内自噬常常发生变化，提示自噬在该过程发挥重要作用[12]。已有研究报道，LC3B-Ⅱ与自噬关系密切，在自噬过程中吞噬物被双层膜包裹，成为自噬小体，运往溶酶体进行降解，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ是双层膜的重要组成部件[13]，因此，LC3B-Ⅱ蛋白表达水平与自噬水平有关，LC3B-Ⅱ表达量高说明自噬活跃。在本研究中，与癌旁组织相比，LSCC组织中LC3B-Ⅱ蛋白表达量明显上调，表明LSCC组织中自噬增强，提示自噬可能参与了LSCC的发生、发展过程，起促癌作用。另外，本研究结果显示，miR-124 mimics组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白表达下调，明显低于mimics NC组；miR-124 inhibitor组细胞中LC3B-Ⅱ蛋白表达上调，明显高于inhibitor NC组；提示过表达miR-124以后，Hep-2细胞的自噬水平下调；干扰miR-124以后，Hep-2细胞的自噬水平上调；提示miR-124在Hep-2细胞中发挥抑制自噬的作用。

西罗莫司为自噬激动剂，可通过抑制mTOR通路而诱导和促进细胞自噬的发生；3-MA为自噬抑制剂，能够通过抑制Ⅲ型PI3K来阻断自噬体形成，从而抑制自噬[14]。本研究细胞侵袭实验显示，miR-124 mimics组侵袭细胞数显著少于mimics NC组和mimics+西罗莫司组，miR-124 inhibitor组侵袭细胞数显著多于inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组；过表达miR-124明显抑制了LSCC细胞的侵袭能力，但加入自噬激动剂后明显恢复LSCC细胞的侵袭能力；抑制miR-124表达明显促进LSCC细胞的侵袭，当加入自噬抑制剂后明显削弱了细胞癌细胞的侵袭能力。而细胞迁移实验结果显示，培养72 h后，inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率显著低于miR-124 inhibitor组；培养96 h后，mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率高于miR-124 mimics组。上述结果提示，过表达miR-124明显抑制了LSCC细胞的迁移能力，但加入自噬激动剂后明显恢复LSCC细胞的迁移能力；抑制miR-124表达明显促进LSCC细胞的迁移能力，当加入自噬抑制剂后明显削弱了细胞癌细胞的迁移能力。因此，miR-124可能通过抑制自噬发挥抑癌作用。但仍然需要进一步明确miR-124作用于自噬通路的靶基因，以完整阐述miR-124调控LSCC细胞侵袭和迁移的机制。

综上所述，人LSCC组织中miR-124表达显著下调，人LSCC组织中以及miR-124过表达细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ显著上调，miR-124可能通过抑制自噬而抑制LSCC细胞的侵袭和迁移。该研究为探讨LSCC的发病机制及临床治疗提供了新的方法和思路。