莱菔硫烷对单侧输尿管梗阻所致小鼠肾纤维化的干预作用及其机制

郭莉，龚幼兰，李晶，任茜，郝捷

(1河北大学附属医院，河北保定071000；2保定市第二医院)

慢性肾脏病(CKD)的特征是过量成纤维细胞活化及增殖，随后肾脏中细胞外基质(ECM)过度积累，改变肾脏结构，导致肾功能障碍并最终引起肾衰竭。许多细胞因子和生长因子可调节间质纤维化的进展。有证据表明，转化生长因子β(TGF-β)是高度有效的纤维化细胞因子[1,2]。TGF-β的下游信号转导包括细胞质Smad2/3磷酸化、与Smad4的复合物形成及随后易位至细胞核[3,4]。此外，TGF-β也被认为可诱导上皮-间质转化(EMT)程序[5]。多项研究表明在肾纤维化中拮抗TGF-β途径可获得积极的治疗效果[6,7]。植物衍生产品及其活性成分是各种疾病药理学干预的重要潜在来源[8]。莱菔硫烷是存在于十字花科蔬菜中的硫基异硫氰酸酯化合物。最近人体研究表明，莱菔硫烷有助于降低某些恶性肿瘤、糖尿病的发病率[9，10]，并可抑制血小板活化以预防动脉血栓形成[11]。既往莱菔硫烷相关研究主要集中在抗癌和抗肿瘤转移方面。2018年10月～2019年5月，本研究观察了莱菔硫烷对肾纤维化小鼠模型的抗纤维化作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 雄性瑞士白化小鼠，鼠龄8～10周，体质量25～30 g，饲养于动物护理设施中，室温(25±2)℃，保持12 h黑暗/光照循环。给动物食用水和正常颗粒饲料，适应性喂养至少1周。莱菔硫烷(S6317)购自Sigma公司。抗肌动蛋白、α-SMA、胶原蛋白Ⅰ、p-Smad2/3、t-Smad2/3、结缔组织生长因子(CTGF)、TGF-β抗体购自Santa Cruz公司。本研究方案获得动物伦理委员会批准。

1.2 肾纤维化模型制作及分组、给药方法 将小鼠随机分为Sham组、Sham+SFN组、UUO组、UUO+SFN组，每组8只。用氯胺酮60 mg/kg、甲苯噻嗪16 mg/kg腹膜内注射麻醉小鼠。UUO组、UUO+SFN组制作肾纤维化模型，进行UUO手术，将左输尿管与丝线缝合，同时保持右肾不受影响。Sham组、Sham+SFN组进行手术但不结扎输尿管。手术后第2天UUO+SFN组、Sham+SFN组腹膜内注射莱菔硫烷25 mg/(kg·d)，Sham组、UUO组分别给予同等剂量的生理盐水，持续给药至第14天[12]。实验第14天心脏穿刺取血并分离血清。

1.3 血肌酐、BUN检测 根据试剂盒说明书检测小鼠血肌酐和BUN，在M5酶标仪上读取数据。

1.4 肾脏质量及肾脏指数测算 于实验第14天用颈椎脱臼法处死小鼠并收集肾组织，PBS洗涤，去除肾周脂肪后称重。将肾脏组织-80 ℃储存，将一小块肾脏组织保持在4%中性甲醛中固定过夜。分级脱水后将组织包埋在石蜡中，切成5 μm的切片，并用HE染色。根据肾脏纤维化损伤近端小管的分级量表(0～4级)进行组织病理学评估[13]。

1.5 肾损伤及肾纤维化程度观察 使用切片机切取5 μm厚的肾标本切片，随后进行HE染色，并进行损伤评分[13,14]，从0(无伤害)到3(严重伤害)划分等级。Masson三色染色法测算肾间质纤维化面积。采用PSR染色评价间质胶原沉积情况，IHC染色联合Image J软件观察并分析胶原蛋白Ⅰ、纤连蛋白表达。

1.6 肾组织中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF检测 采用Western blotting法检测，使用Image J软件对显影的印迹进行光密度定量，用肌动蛋白标准化后表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组血肌酐、BUN水平比较 UUO组小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham组，UUO+SFN组血肌酐、BUN水平低于UUO组(P均<0.01)。见表1。

表1 各组血肌酐、BUN水平比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与UUO组相比，#P<0.01。

2.2 各组肾脏质量、肾脏指数比较 UUO组肾脏质量和肾脏指数低于Sham组，UUO+SFN组肾脏质量和肾脏指数高于UUO组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肾脏质量和肾脏指数比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与UUO组相比，#P<0.05。

2.3 各组肾损伤及肾纤维化程度比较 HE染色显示UUO组小鼠肾小管萎缩，刷状缘丧失，UUO+SFN组较UUO组上皮细胞空泡化改善。UUO组肾小管损伤评分高于Sham组，UUO+SFN组肾小管损伤评分低于UUO组(P均<0.01)。Masson三色染色显示，UUO组纤维化面积高于Sham组，UUO+SFN组纤维化面积低于UUO组(P均<0.01)。见图1、表3。PSR染色显示UUO组间质胶原沉积显著，UUO+SFN组胶原沉积明显减少。UUO组PSR阳性面积、胶原蛋白Ⅰ及纤连蛋白表达高于Sham组，UUO+SFN组PSR阳性面积、胶原蛋白Ⅰ及纤连蛋白表达低于UUO组(P均<0.01)。见图2、表3。

注：A为HE染色显微镜下图片；B为Masson三色染色显微镜下图片。

图1各组小鼠肾组织HE染色、Masson三色染色镜下显示图像

图2 各组小鼠肾小管间质纤维化、胶原蛋白Ⅰ、纤连蛋白表达情况

表3 各组肾小管损伤评分、纤维化面积、PSR阳性面积、胶原蛋白Ⅰ、纤连蛋白表达比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与UUO组相比，#P<0.01。

2.4 各组肾组织中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表达比较 UUO组TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相对表达量高于Sham组，UUO+SFN组TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相对表达量低于UUO组(P均<0.01)。见图3、表4。

图3 各组肾组织中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表达情况

3 讨论

肾纤维化的特征在于ECM的过量产生导致肾功能逐渐受损。虽然纤维化疾病的发病率呈上升趋势，但目前仍然没有药物有效干预其进展。肾脏中过量基质沉积产生机械拉伸，渗透压应力，募集炎症细胞并增强导致肾损伤和纤维化的不同信号级联。多项证据表明，莱菔硫烷是一种抗癌化合物[19, 20]。莱菔硫烷是一种天然存在的异硫氰酸盐，在某些十字花科蔬菜中含量很高。L-莱菔硫烷是具有生物活性的异构体，而D，L-莱菔硫烷是L-莱菔硫烷的合成外消旋类似物。同时，莱菔硫烷是一种具有细胞保护作用和抗癌特性的抗氧化剂，已被证明可诱导Ⅱ期酶的活性，如血红素加氧酶1(HO-1)、醌还原酶、谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽还原酶[10]。据报道，莱菔硫烷还可以通过诱导转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)依赖性Ⅱ期酶的活化来保护肾脏和大脑免受缺血性损伤[11]。然而，目前对莱菔硫烷的肾脏保护活性及抗肾纤维化活性研究较少。

表4 各组肾组织中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表达比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与UUO组相比，#P<0.01。

UUO诱导的肾纤维化动物模型是一种成熟且经过验证的模型。本研究制作了UUO诱导的肾纤维化小鼠模型，并给予莱菔硫烷治疗，结果显示，UUO组肾脏质量和肾脏指数低于Sham组，UUO+SFN组肾脏质量和肾脏指数高于UUO组；UUO组小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham组，UUO+SFN组血肌酐、BUN水平低于UUO组。肌酐清除率是反映肾功能的最重要参数之一，血清BUN水平升高表明肾功能降低。本研究结果表明，使用莱菔硫烷后，肾纤维化小鼠肾功能受损减轻，证实了莱菔硫烷对肾脏的保护作用。进一步观察发现，UUO组肾小管损伤评分、纤维化面积、PSR阳性面积、胶原蛋白Ⅰ及纤连蛋白表达高于Sham组，UUO+SFN组上述指标均低于UUO组，提示莱菔硫烷有助于减轻小鼠肾纤维化和肾小管损伤。

有学者发现TGF-β在诱导纤维化信号转导中起着重要作用[1]。此外，TGF-β在肾小管细胞EMT中也起关键作用[16]。由于TGF-β广泛参与多项生理功能，尚未发现直接抑制TGF-β可以有效治疗纤维化。然而，有研究表明，抑制活化的TGF-β信号转导有益于延缓不同条件下的纤维化[17,18]。本研究试图从TGF-β信号转导和EMT方面分析莱菔硫烷的作用机制，实验结果显示，UUO组TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相对表达量高于Sham组，UUO+SFN组TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相对表达量低于UUO组，提示莱菔硫烷对肾纤维化的干预作用可能与抑制TGF-β通路信号转导有关。