丹蛭降糖胶囊治疗大鼠糖尿病牙周炎的效果及牙周组织中骨钙素表达变化

董蕾，方朝晖，徐培

(1安徽医学高等专科学校，合肥230601；2安徽中医药大学第一附属医院)

牙周炎是由牙菌斑引起，以牙周组织渐进性附着丧失和骨吸收为特征的口腔常见疾病，最终可导致牙齿丧失。牙周炎作为糖尿病并发症之一，逐渐受到广大学者的关注。近年来，多项研究逐渐证实牙周炎与糖尿病之间的双向关系[1，2]，即糖尿病增加了牙周组织对牙菌斑的易感性，引起牙周炎的发生发展；同时牙周炎对糖尿病的代谢调控也有负面影响，控制牙周炎症有助于调节糖尿病患者的血糖。骨钙素(BGP)作为新型骨转换和骨形成的特异性标志物，在骨钙代谢中起重要的调节作用，其水平反映成骨细胞活性。近年来研究显示，骨钙素可能通过改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌等途径参与糖代谢调节[3，4]。丹蛭降糖胶囊(DJC)具有益气、养阴、活血功效，在降低血糖、血脂、调控炎症因子、防治糖尿病血管并发症等方面具有显著效果[5]。2015～2018年本研究观察了DJC治疗大鼠糖尿病牙周炎的效果及牙周组织中BGP表达变化，初步探讨DJC在糖尿病牙周炎治疗方面的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 动物与主要实验材料 清洁级健康雄性Wistar大鼠80只[许可证号SCXK(京)2016-0002]，10周龄，体质量(250±20)g，由北京思北福生物有限公司提供。DJC由安徽中医药大学第一附属医院内分泌科提供。链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司。TRIzol试剂购于Invitrogen公司(批号10296028)。Ultra Pure Agarose、SuperScript Ⅲ RT反转录kit、Sybr qpcr mix购于ABI-invitrogen公司。计算机病理图像采集与分析系统(LEICA公司，型号4000B)，台式高速冷冻离心机(THERMO公司，型号LEGEND MICRO 21R)，核酸浓度测定仪(THERMO公司，型号Nanodrop little)，qPCR仪(Applied biosystems公司，型号7900 Fast)，电泳仪、凝胶成像仪(Biorad公司，型号EPS 300、2500)。

1.2 动物分组、模型制作及给药处理 选择健康雄性大鼠80只，适应性喂养7 d后随机选择20只作为健康对照组(CTL组)，给予正常基础饲料喂养。其余60只大鼠给予高脂高糖饲料喂养，4周后腹腔注射45 mg/kg STZ诱导糖尿病，注射3 d后取尾静脉测空腹血糖及尿糖；连续3 d 空腹血糖≥15 mmol/L、尿糖达+++、第7天空腹血糖≥16.7 mmol/L则视为糖尿病模型制作成功。糖尿病建模成功后1周，给予腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉，采用0.2 mm正畸结扎钢丝结扎双侧上颌第一磨牙牙颈部，要求钢丝位于龈沟内但不损伤结合上皮。建模成功标准：上颌第一磨牙组织切片可见结合上皮根向增殖，形成牙周袋，牙龈组织内炎症细胞浸润，胶原纤维紊乱，牙槽嵴吸收等。将60只建模成功的糖尿病牙周炎大鼠随机分成糖尿病牙周炎对照组(DP组)20只、牙周基础治疗组(DP+BT组)20只、牙周基础治疗加DJC组(DP+BT+DJC组)20只。DP+BT组和DP+BT+DJC组大鼠在麻醉下行牙周基础治疗：常规实施洁治术以消除菌斑和结石，3%双氧水冲洗牙周袋后注入少许1%碘甘油。DP+BT+DJC组大鼠行牙周基础治疗后以DJC灌胃，根据大鼠等效剂量计算并给予DJC 0.47 g/(kg·d)，连续给药2个月。CTL组、DP组和DP+BT组用等体积的生理盐水灌胃，连续用药2个月。

1.3 血糖检测 给药2个月后进行尾静脉采血，测空腹血糖。

1.4 牙龈炎症程度评估 处死大鼠后截取包括第一磨牙的双侧上颌骨，部分组织立即放入-80 ℃液氮中冷冻备用。另一部分组织经固定、脱钙，常规石蜡包埋，沿牙体长轴近远中向制作成5 μm厚的组织切片，进行HE染色。通过计算机病理图像采集与分析系统，选择第一磨牙近中牙龈上皮层和固有层内45 μm×70 μm视野中的炎症细胞(单核细胞和淋巴细胞)计数，以量化牙龈组织的炎症程度。

1.5 牙周组织BGP mRNA检测 取包括第一磨牙的上颌骨组织，提取总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA进行反转录为cDNA，再进行RT-qPCR扩增，以GAPDH为内参。根据NCBI检索目的基因全长碱基序列，应用Primer Premier6.0软件设计PCR特异性引物，送北京梓熙生物公司合成。BGP mRNA上游引物序列为5′-ATTGTGACGAGCTAGCGGAC-3′、下游引物序列为5′-TCGAGTCCTGGAGAGTAGCC-3′，GAPDH上游引物序列为5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′、下游引物序列为5′-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。以2-ΔΔCt表示BGP mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖水平比较 CTL组、DP组、DP+BT组、DP+BT+DJC组血糖水平分别为(5.67±0.91)、(19.44±2.73)、(13.74±2.31)、(7.78±2.34)mmol/L，DP+BT组、DP+BT+DJC组血糖水平低于DP组，但仍高于CTL组,DP+BT+DJC组低于DP+BT组(P均<0.05)。

2.2 各组大鼠牙龈组织炎症程度比较 CTL组、DP组、DP+BT组、DP+BT+DJC组第一磨牙近中牙龈上皮层和固有层内炎症细胞计数分别为(4.02±0.70)、(23.1±1.3)、(19.7±1.1)、(13.7±2.4)个，DP+BT+DJC组炎症细胞计数低于DP组和DP+BT组，但仍高于CTL组(P均<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠牙龈组织中炎症细胞浸润情况

2.3 各组大鼠牙周组织中BGP mRNA表达比较 CTL组、DP组、DP+BT组、DP+BT+DJC组牙周组织中BGP mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.60±0.12、0.84±0.02、1.00±0.02。DP组、DP+BT组牙周组织中BGP mRNA相对表达量低于CTL组(P均<0.05)，DP+BT+DJC组牙周组织中BGP mRNA相对表达量高于DP组、DP+BT组(P均<0.05)。

3 讨论

长期高血糖状态可危及多种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经等，发生各类糖尿病并发症。牙周炎是常见的牙周支持组织的慢性炎症，炎症逐渐累及牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质，最终导致牙齿松动脱落，发病率高，危害大。革兰阴性厌氧菌为主的牙菌斑为牙周炎的始动因子，食物嵌塞、咬合创伤等为促进因素，而糖尿病等全身因素与牙周炎有关[6]。近年来，关于牙周炎与糖尿病之间的关系研究较多。现已证实，糖尿病可增加牙周炎的易感性，机制包括：①高血糖减少唾液分泌量，改变唾液成分，从而改变牙周菌群；②高血糖造成白细胞趋化和吞噬功能缺陷，降低患者抗感染能力[7，8]；③高血糖改变牙周血管状态，导致组织修复能力和再生力下降[9]；④高血糖抑制成纤维细胞和成骨细胞的活力，导致牙周附着丧失、牙槽骨吸收增加等，加重对牙周组织的破坏[10]。另一方面，持续发展的牙周炎不利于血糖控制，牙周治疗对血糖控制具有积极作用[8]。

糖尿病属中医“消渴病”范畴。糖尿病慢性并发症如牙周炎等的病因病机中，气阴两虚为本，气滞、痰浊、瘀血为标，为本虚标实之证，故采取益气健脾、滋阴生津、补益肝肾以治本，活血化瘀、化痰泻浊、理气以治标。临床实践发现，益气养阴、活血化瘀治疗不仅可以明显改善糖尿病慢性并发症的症状，也可以降低血糖、调整血脂代谢、改善微循环等。DJC具有益气养阴、活血通脉功效，其具体组方为太子参18 g、生地黄15 g、丹皮12 g、菟丝子12 g、泽泻9 g、水蛭9 g，共六味药物。临床及实验研究均提示，DJC能改善糖尿病机体的糖尿病胰岛素抵抗，保护胰岛β细胞功能，清除氧自由基，保护氧化应激损伤组织，具有良好的降糖作用。

本研究结果显示，DP+BT组、DP+BT+DJC组血糖水平低于DP组，高于CTL组，且DP+BT+DJC组低于DP+BT组；DP+BT+DJC组炎症细胞计数低于DP组、DP+BT组。糖尿病牙周炎大鼠牙周组织内牙龈附着根方分离，胶原纤维水肿变性，排列紊乱，大量炎症细胞浸润；DJC治疗后牙龈上皮完整，结合上皮附着基本正常，纤维排列清楚，炎症减轻。这表明，DJC可降低糖尿病牙周炎大鼠血糖水平，同时控制牙周炎症，牙周组织的炎症控制与血糖控制情况基本一致。研究也表明，控制血糖可减轻糖尿病对牙周组织的破坏，提高局部抗感染能力[11]，增强牙周组织的修复能力和再生力，延缓牙周附着丧失和牙槽骨吸收。

BGP是一种由成骨细胞、成牙质细胞等合成的维生素K依赖性钙结合蛋白，属于非胶原酸性糖蛋白，在骨钙代谢中起重要调节作用，是骨转换和骨形成的特异性标志物。糖脂代谢紊乱是糖尿病的典型特征，可影响非胶原酸性糖蛋白的形成，从而抑制成骨细胞、成牙骨质细胞等的活性，导致骨代谢异常，骨密度降低[12～14]。同时，骨骼通过分泌BGP，可调节胰岛素的分泌。有研究发现，糖尿病患者血清BGP水平过低可导致胰岛素敏感性、葡萄糖耐量降低，从而加重病情[15]。有学者[16]研究认为，BGP水平变化可能直接反映药物对牙槽骨的骨形成和骨重建的影响。本研究结果显示，DP组、DP+BT组牙周组织中BGP mRNA相对表达量低于CTL组，DP+BT+DJC组牙周组织中BGP mRNA相对表达量高于DP组、DP+BT组。由上述结果可见，DJC干预了BGP mRNA的表达。推测糖尿病牙周炎大鼠通过活化炎症、炎症细胞释放各种细胞因子如IL-6等打破了破骨细胞和成骨细胞之间的平衡，致使骨代谢异常[17～20]。给予DJC治疗后，不仅病理改变显著，并且BGP表达明显提高，再次表明DJC具有减轻牙周组织细胞损伤、上调BGP表达、控制局部炎症的效果。上调牙周组织内BGP表达,有望成为治疗糖尿病牙周炎的新方向。

综上所述，DJC治疗大鼠糖尿病牙周炎可降低血糖水平，减轻牙龈组织炎症程度，上调BGP mRNA的表达。本研究结果为DJC防治糖尿病牙周炎提供了一定的实验依据。