氧化石墨烯对淡水微藻生长及生物活性物质的影响

彭晓玲,孟范平,张 倩,杜树豪,段伟艳

氧化石墨烯对淡水微藻生长及生物活性物质的影响

彭晓玲,孟范平*,张 倩,杜树豪,段伟艳

(中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛 266100)

为掌握氧化石墨烯(GO)的水环境风险,以斜生栅藻()和湖泊微拟球藻()为研究对象,探究了GO对淡水微藻生长及其生物活性物质(碳水化合物、总蛋白质、总脂)的影响.结果表明,GO对2种微藻具有中等毒性,72h EC50值分别为25.63和48.44mg/L.透射电镜(TEM)观察发现,GO纳米片层既能附着于藻细胞表面也能进入藻细胞内部,造成藻细胞超微结构明显变化,包括:质壁分离;叶绿体收缩;淀粉粒数量减少甚至消失.较低浓度(10mg/L)GO会促进微藻中光合色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)合成;而较高浓度(100mg/L)GO暴露下,2种微藻的类胡萝卜素和斜生栅藻叶绿素a的含量显著降低.2种浓度的GO总体上刺激了藻细胞内生物活性物质的合成,这是污染胁迫下的一种主动防御机制;而较高浓度GO造成碳水化合物含量显著降低,可能原因是细胞中储能物质由淀粉向中性脂转化.

氧化石墨烯(GO)；斜生栅藻；湖泊微拟球藻；光合色素；生物活性物质

氧化石墨烯(GO)是石墨烯的氧化物,在二维平面结构的表面和边界连接有羧基、羟基、环氧基等含氧官能团[1],使其能够均匀分散在水中,形成稳定的胶体溶液[1].此外,GO还具有比表面积大、导电性能优良、化学性质稳定等优点,因而被广泛应用于电子器件、催化氧化、生物技术、重金属废水吸附净化等领域[2-5].在大量应用过程中,GO不可避免地被排放到水环境中.作为一种碳纳米材料(三维空间中有一维的尺寸小于100nm),GO能否对水生生态产生不利影响,最近10a来受到越来越多的关注.

微藻是一类广泛存在于水生生态系统中的光合自养生物,它们是生物质生产的主要来源,用于支持其他营养级水生生物的生长.例如,斜生栅藻的细胞内含有丰富的蛋白质,是轮虫、草食性鱼类、甲壳类及软体动物的良好饵料[6];微拟球藻也是水产动物幼苗的常见开口饵料[7-8].因此,微藻的生长状况及其营养成分的优劣直接关系到高营养级生物的正常生长以及水生生态系统的稳定.GO暴露会抑制微藻生长[2,9-11],阻碍细胞分裂,引起光合色素含量和抗氧化酶活性变化[12].目前有关GO对微藻影响的研究主要集中在致毒机制方面,而对微藻体内大分子活性物质的影响几乎未见报道.

本研究拟以我国常见的2种淡水饵料藻——斜生栅藻()和湖泊微拟球藻()为受试生物,在进行GO对微藻生长抑制试验并确定其毒性等级基础上,通过测定GO暴露下的微藻中色素、碳水化合物、总蛋白质、总脂含量变化,分析水环境中存在的GO对微藻光合作用和生物活性物质合成的影响,为评估GO的水生生态风险提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

GO分散液:购自中国厦门凯纳石墨烯技术有限公司,由改进的Hummer法制成,浓度3000mg/L,介质为超纯水,pH值为5~7.根据前文[13]研究,这种GO在超纯水中为二维片层结构,长度171.0~412.5nm (平均291.3nm),厚度为1.25nm.

微藻种类和培养基:斜生栅藻()和湖泊微拟球藻()均购自中国科学院海洋研究所,采用BG11培养基培养到指数生长期.培养基的组成为[14]:每L蒸馏水中含有1500mg NaNO3、40mg K2HPO4、75mg MgSO4·7H2O、36mg CaCl2·2H2O、6mg柠檬酸、6mg 柠檬酸铁铵、1mg Na2EDTA、20mg Na2CO3、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2·4H2O、0.222mg ZnSO4·7H2O、0.391mg Na2MoO4·2H2O、0.079mg CuSO4·5H2O和0.049mg Co(NO3)2·6H2O,pH值为7.62.

试剂:丙酮、HClO4、NaOH、苯酚、硫酸、氯仿、甲醇、葡萄糖、K2CrO7、棕榈酸(配制脂肪酸标准液)、戊二醛等试剂均为国产分析纯.蛋白质试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

1.2 方法

1.2.1 微藻的暴露培养 对于每一种微藻,在一系列装有200mL BG11培养基的锥形瓶中,加入一定体积的GO分散液,使其浓度分别为0,1,10,50,100, 150mg/L,每组3个平行,利用超声波细胞粉碎机(JY92-II型,宁波新芝,150W)超声振荡1h后,接种处于指数生长期的微藻(初始浓度约5×105cells/mL).在上述条件下暴露培养72h,每天回旋手摇3次,每次30s,使藻液混合均匀.每隔24h,利用血球计数板在显微镜(YS2-H型,日本尼康公司)下计数,测定藻细胞密度.

1.2.2 72h半抑制浓度计算 根据经济合作与发展组织(OECD)“化学品对微藻生长抑制试验指南”[15]计算GO对2种微藻的EC50:首先绘制基于藻细胞密度的72h生长曲线,并按照式(1)计算生长曲线下的面积:

式中:为生长曲线与坐标轴所包围的面积;0为0时刻的起始藻细胞数,cells/mL;1为1时刻的藻细胞数,cells/mL;N为t时刻的藻细胞数,cells/mL;1为试验开始后第一次的测定时间;t为试验开始后第次的测定时间.

然后按式(2)计算每一处理浓度下的藻细胞生长抑制百分率(IR):

式中:c为对照组的生长曲线与坐标轴包围面积;A为处理组的生长曲线与坐标轴包围面积.

最后,利用概率单位-浓度对数法,通过直线回归得到GO浓度对数()—概率单位(,由百分数与概率单位对照表查得)的关系方程.当概率单位为5.0时,可计算得到72h EC50.

1.2.3 色素测定 取2mL藻液,5000r/min离心15min,弃去上清液后,加入2mL 80%丙酮,摇匀,于黑暗处抽提24h后,再次以5000r/min离心15min,取上清液,利用紫外可见分光光度计(TU-1810型,北京普析通用仪器公司)分别测定波长663,646和470nm处的吸光度(),根据式(3)[16]计算叶绿素a(Chl)、叶绿素b(Chl)和类胡萝卜素(Car)含量:

1.2.4 总蛋白质、总碳水化合物和总脂测定 总蛋白质浓度采用南京建成生物工程研究所生产的蛋白试剂盒(考马斯亮蓝法)测定.取100mL藻液于4℃、10000r/min离心15min,弃去上清液.将藻泥用预冷的0.2mol/L HClO4抽提2次后,向其中加入1mL 1mol/L NaOH,沸水浴10min至充分溶解.用试剂盒测定溶液中的总蛋白含量,单位为mg/106cells.总碳水化合物测定采用苯酚-硫酸法[17].将2mL藻液与2mL 90%苯酚溶液充分混合后,迅速加入5mL浓H2SO4,100℃水浴加热15min,冷却后于485nm处测定吸光度.以葡萄糖标准液替代藻液制作标准曲线,计算碳水化合物的浓度,单位为mg/106cells.总脂测定采用重铬酸盐氧化法[18].向HClO4抽提后的藻泥中加入氯仿-甲醇溶液(1:1/),反复抽提2次.将上清液与0.2倍体积水混合,振荡5min后收集下层有机相,用N2吹至最终体积为2mL.将其与2mL 2.5g/L K2CrO7混合,沸水浴45min充分反应,冷却后于350nm波长下测定吸光度.利用脂肪酸标准液绘制标准曲线,计算样品中总脂含量(mg/106cells).

1.2.5 透射电镜(TEM)观察 取2mL藻液至离心管中,4℃下3000r/min离心15min,弃去上清液,按照1:50(/)向收集的藻泥中加入2.5%戊二醛,固定4h后,用PBS(pH=7.8,0.lmol/L)清洗3次,1%锇酸固定90min,再用PBS清洗3次,用丙酮以10%的递增率逐级脱水后(每次10min),环氧树脂渗透、包埋,超薄切片机切片,柠檬酸铅染色后置于TEM下观察拍照[19].

1.2.6 数据统计与分析 各处理组或对照组中每个指标的结果以3个平行测定值(平均值±标准差)表示,通过单因素方差分析(ANOVA)进行差异显著性分析,显著性水平为<0.05,数据统计分析使用SPSS 18.0软件.

2 结果

2.1 GO暴露对微藻生长及其超微结构影响

由图1可见,随着培养时间延长,对照组和处理组的藻细胞密度均呈上升趋势.在培养初期(0~24h),各GO处理组(浓度1~150mg/L)的藻细胞生长均未受到明显影响.但在24h后2种微藻的生长开始受到抑制,且抑制程度随着GO浓度的增加而增大.培养72h时,最高浓度处理组(150mg/L)的斜生栅藻、湖泊微拟球藻的藻细胞密度分别比同期对照组降低44.4%和63%.基于概率单位法计算的GO对2种微藻的72h EC50值分别为25.63和48.44mg/L(表1).

在微藻生长受到GO抑制的同时,藻细胞微观结构也发生变化(图2).对照组的微藻细胞呈饱满的卵圆形,细胞壁以及细胞核、叶绿体、淀粉粒、线粒体等细胞器清晰可见(图2(a)、(c)),而暴露于100mg/L GO后,2种微藻均出现明显的质壁分离现象,细胞形状变得不规则.同时观察到GO在细胞表面附着,且能够进入细胞壁和质膜之间(图2(b)、(d)中箭头),导致细胞壁的轮廓模糊不清.此外,随着藻细胞因质壁分离而变小,叶绿体的收缩也非常明显;淀粉核、淀粉粒的数量和体积急剧减小,在斜生栅藻细胞中几乎看不到淀粉粒分布(图2(b)、(d)).

图2 微藻细胞TEM

a,c分别为对照组中的斜生栅藻和湖泊微拟球藻; b,d分别为100mg/L GO处理下的斜生栅藻和湖泊微拟球藻.Cw 细胞壁;Pm质膜;N 细胞核;M 线粒体;CHL 叶绿体;PC淀粉核中心;Psp淀粉鞘;S 淀粉粒;L 油脂小球;Cy细胞质基质.黑色箭头指向GO,白色双向箭头表示质壁分离

表1 GO对2种微藻的72h EC50

注:#是转化自%的概率,是GO浓度对数值(lg).

2.2 GO暴露下微藻光合色素含量变化

*<0.05水平上差异显著

以GO对2种微藻的72h EC50值为参考值,设置2个浓度组(10、100mg/L),比较微藻在低、高浓度GO中暴露72h后的色素含量变化.由图3可见,在不含GO的对照组中,斜生栅藻的光合色素含量均高于湖泊微拟球藻.低浓度(10mg/L)GO暴露下, 2种微藻的色素含量均显著增加,斜生栅藻的Chl、Chl和Car分别比对照组增加37.56%、36.83%、37.83%,而湖泊微拟球藻分别增加38.01%、35.82%、17.14% (<0.05).高浓度(100mg/L) GO对2种微藻色素的影响并不一致,其中,斜生栅藻的Chl和Car含量分别比对照组降低29.68%和18.26%(<0.05),而湖泊微拟球藻的Chl无显著变化,Chl、Car含量分别比对照组增加31.99%和降低58.07%(<0.05).

2.3 GO暴露下微藻总蛋白质、总脂、碳水化合物含量变化

如图4所示,低浓度(10mg/L)GO暴露72h后,2种微藻的碳水化合物含量均显著增加(<0.05),增幅分别为13.11%和44.3%;高浓度(100mg/L)GO暴露同样时间,斜生栅藻的碳水化合物含量显著降低(降幅为25.6%);而湖泊微拟球藻的碳水化合物含量显著升高(增幅为37.8%).

浓度10,100mg/L的GO处理组中,斜生栅藻和湖泊微拟球藻的总蛋白含量均显著高于各自的对照水平(<0.05),低浓度GO暴露使两者分别增加88.27%、27.27%,高浓度GO暴露使两者分别增加61.17%、126.26%.

*<0.05水平上差异显著

高浓度GO能够促进斜生栅藻、湖泊微拟球藻的总脂合成,其含量增幅分别为61.74%和151.08% (<0.05);低浓度GO暴露只能引起湖泊微拟球藻总脂含量明显升高(<0.05,增幅54.11%).

3 讨论

3.1 GO暴露下微藻的生长抑制

表2 GO与其它纳米材料对2种微藻的生长抑制作用(EC50)比较

注:#n-Al2O3、n-TiO2、n-ZnO和n-CuO分别表示氧化铝、二氧化钛、氧化锌和氧化铜纳米颗粒.

微藻暴露于纳米碳材料后的生长抑制是一种普遍现象[20],但是抑制程度因藻种而异.按照我国《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154-2004)[21]提出的生态毒理学危害性分级标准,GO对2种淡水藻(斜生栅藻和湖泊微拟球藻)均具有中等毒性(72h EC50介于10~100mg/L),只是斜生栅藻对GO的敏感性较高.与文献报道的纳米材料对斜生栅藻的72h EC50值相比(表2),GO的急性毒性与TiO2纳米颗粒(n-TiO2)相仿,但明显低于氧化锌纳米颗粒(n-ZnO)和氧化铜纳米颗粒(n-CuO),而高于氧化铝纳米颗粒(n-Al2O3).这种差异可能与纳米材料的结构、形态、成分不同有关.其他纳米材料对湖泊微拟球藻生长抑制的研究尚未见报道.根据为数不多的有关GO对微藻毒性的研究可见,湖泊微拟球藻对GO的耐受性较高(表2).

3.2 GO暴露对微藻超微结构的影响

GO在藻细胞内外均有分布(图2(b)、(d)),表明表面附着和内化作用同时存在.附着在细胞表面的GO会通过遮蔽效应减少藻细胞对光的利用[27-28],也可通过堵塞细胞壁而干扰营养物质运输和离子交换[29],从而抑制微藻生长.但是,这种附着的机制目前尚不清楚.BG11培养基的介质为蒸馏水,之前的研究测得GO在淡水中的Zeta电位为-47.05mV[13]. Zeta电位是表征分散体系稳定性的重要指标.其绝对值越高,胶粒之间的排斥力越大.当Zeta电位绝对值处于40~60mV之间时胶体分散系具有较好稳定性[30].此外,微藻的等电点一般在pH=3[31],GO的等电点在pH=3以下[32],在本研究所采用的培养体系(pH值均在7以上或接近7)中,它们的表面均带负电荷,相互间的静电作用表现为斥力.因此,GO不可能通过其自身凝聚或其与藻细胞之间的静电作用而附着于藻细胞表面.最近,Ouyang等[10]通过红外光谱分析发现,藻细胞表面附着GO后,O−H、N−H、C−H、C=N、N−N峰增加,而单独检测GO、藻细胞时均未出现这些化学基团,由此提出,纳米材料上的含氧、含氢基团通过疏水、受体与配体以及氢键相互作用使其结合于细胞表面.笔者认为,由于GO表面含有羧基、羟基和烷氧基[1,32],而藻细胞壁上的多糖、蛋白质、脂类等生物大分子富含酰胺基、羧基、羟基等官能团[33],因此,两者之间容易通过形成氢键和共价键而结合.

GO引起藻细胞质壁分离现象在前人研究GO对普通小球藻()[10]的影响时也有发生.但是其机制仍不清楚.微藻出现质壁分离后,其细胞壁并未破损,此时,尺寸大于细胞壁孔径(5~ 20nm[27])的GO(超纯水中呈二维片层结构,平均长度291.3nm,厚度1.25nm[13])仍能进入细胞内(图2(b)、(d)),这很可能是由于细胞的内吞作用所致.真核细胞普遍存在着由网格蛋白介导的内吞作用,可直接从胞外获取大分子和颗粒状物质.Ouyang等[10]根据暴露于GO的普通小球藻的TEM和拉曼成像认为,GO通过内吞作用进入微藻细胞质中.在100mg/L的GO暴露下,藻细胞的另一个典型超微结构变化是淀粉核、淀粉粒变少变小(图2(b)、(d)),这和文献[10]报道10mg/L的GO引起普通小球藻细胞中淀粉粒数量增多并不一致,可能是因为不同研究者所用的GO浓度不同.作为对环境胁迫的一种适应机制,藻细胞在生长逆境(氮磷营养盐不足、高盐度等)下,会将光合作用固定的碳源更多用于储能物质(淀粉或脂质)积累[34-36].但是,淀粉只是胁迫初期碳和能量的存储形式,随着胁迫程度增加,淀粉则转化为中性脂,引起细胞内脂质含量上升[36-37].本研究中,藻细胞淀粉粒数量减少(图2)的同时,总脂含量却在上升(图4),证明100mg/L GO能够引起微藻的储能物质由淀粉向脂质转化.

3.3 GO暴露下微藻的光合色素变化

除了影响微藻的超微结构外,GO还能引起藻细胞光合色素含量的变化.绿藻等大多数微藻的光合色素主要为Chl、Chl和Car[38].本研究中,较低浓度(10mg/L)的GO能够刺激2种微藻中各种色素合成,这是微藻对GO遮光效应的一种应激响应[39],其目的是优化光的利用率,增加藻细胞对光的吸收,以消除遮光带来的不利影响.然而,随着培养体系中GO浓度增加,进入细胞内的GO增多,并产生大量活性氧(ROS)[40],而类囊体膜及其表面的光合色素因含有不饱和多烯结构极易受到ROS攻击,造成叶绿体结构破坏和色素氧化分解.暴露于100mg/L GO后,2种微藻的叶绿体明显缩小(图2(b)、(d)),Car含量和斜生栅藻Chl含量显著降低(图3),可证明高浓度GO对光合器官和色素的不利影响.在光合系统中,Car不仅是一种辅助色素,还具有抗氧化作用(吸收激发态单线态氧等ROS,以避免其他生物大分子受到氧化性分解)[41].因此,在逆境胁迫下Car比其他色素较早受到影响.需要注意的是,高浓度GO处理组的微藻Chl含量无变化甚至显著增加(图3),而且Chl/Chl比值显著低于对照组(< 0.05)(表3),表明Chl对GO的耐受性高于Chl.李威等[42]报道,蛋白核小球藻()和羊角月牙藻()的Chl对5-氟尿嘧啶的敏感性均高于Chl.较低的Chl/Chl比值会干扰光合系统II(PSII)的集光叶绿素蛋白复合体(LHC)形成,降低藻细胞的光合效率和光吸收能力[43].根据上述比较,微藻光合色素对GO的敏感性顺序依次为:Car> Chl>Chl.师玥[44]研究青岛大扁藻()光合色素对Cu2+急性毒性胁迫的响应时也发现同样现象.

表3 暴露于GO 72h后2种微藻的细胞内Chla/Chlb含量之比

注:*<0.05水平上具有显著性差异.

3.4 GO暴露对微藻碳水化合物、总蛋白质、总脂含量的影响

碳水化合物、总蛋白和总脂是植物细胞中3类重要的生物活性物质.其中,碳水化合物既是细胞壁的主要成分,也是细胞的能量储存库.微藻在逆境胁迫下生长抑制,繁殖速度较慢,胞内有机物质积累,碳水化合物的含量较高[45],可溶性糖能有效捕获ROS和清除环境胁迫下藻细胞中的自由基[46].蛋白质是藻细胞正常生理功能的物质保障,其含量变化可反映藻细胞受损情况[47],可溶性蛋白质含量增加被认为是防止藻细胞受到非生物胁迫损害的一种主动防御机制[48].藻细胞内总脂组成多样,不仅可作为构成细胞膜的主要组分(如磷脂),还是细胞重要的能量和碳储存库(以中性脂形式沉积在脂肪滴中)[49-50].在本研究所设计的浓度下,GO总体上促进了藻细胞内碳水化合物和总蛋白的生成(图4),这是藻细胞抵御GO胁迫的一种应激反应.Barreto等[51]也发现,小球藻()在浓度393~769μg/L纳米铜中暴露72h后,其总蛋白含量显著增加.高浓度GO暴露下斜生栅藻碳水化合物含量的降低,伴随着总脂含量的显著增加,表明处于严重胁迫的细胞中储能物质由淀粉向中性脂转化[34-35].这也是GO对斜生栅藻生长具有较高抑制作用(72h EC50较低)的原因.此外,低、高浓度GO均会造成2种微藻细胞中总脂的积累(图4).根据文献报道,其它纳米材料对微藻也有类似影响.例如,添加n-TiO2和UV-A照射可诱导普通小球藻(UTEX 265)细胞内脂质的生成[52].浓度5.1mg/L的零价铁纳米颗粒(nZVI)显著增加湖泊微拟球藻等6种微藻的脂质含量[53].纳米材料促进微藻脂质合成与其产生的氧化逆境有关.因为GO能够诱导藻细胞内ROS(氧化逆境的典型标志)过量产生已被很多研究[54,40]所证实,而ROS在促进微藻脂质合成中起着介导作用[55].逆境胁迫下生成脂质作为储能物质,有利于微藻抵御外界环境变化,实现机体自我保护.

4 结论

4.1 GO对斜生栅藻和湖泊微拟球藻的72h EC50分别为25.63和48.44mg/L,均属中等毒性.

4.2 GO通过附着于藻细胞表面和进入藻细胞内影响微藻生长.超微结构主要变化包括:①质壁分离;②叶绿体明显收缩;③淀粉核、淀粉粒的体积和数量急剧减小.

4.3 微藻光合色素对GO敏感性顺序为:Car> Chl>Chl.GO能刺激藻细胞内3种生物活性物质合成,是污染胁迫下的主动防御.高浓度GO造成碳水化合物含量显著降低,可能原因是细胞中储能物质由淀粉向脂质转化.

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Effects of graphene oxide on the growth and bioactive compounds in freshwater microalgae.

PENG Xiao-ling, MENG Fan-ping*, ZHANG Qian, DU Shu-hao, DUAN Wei-yan

(Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)., 2019,39(11)：4849~4857

To understand the risk of graphene oxide (GO) to aquatic environments, the effects of GO on the growth and three bioactive compounds including carbohydrate, total protein and total lipid, in two species of freshwater microalgae,and, were investigated in this study. Results showed a moderate toxicity of GO to both species with the 72h EC50values of 25.63mg/L and 48.44mg/L, respectively. Transmission electron microscopy (TEM) images displayed that GO nanosheets not only adhered to the cell surfaces but also entered the cells, which induced obvious changes in ultrastructure, including plasmolysis, shrinkage of chloroplasts, and the decrease or even disappearance of starch grains. Synthesis of three photosynthetic pigments (chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid) in microalgae was promoted at lower concentration (10mg/L) of GO after 72h exposure. However, contents of carotenoid in the cultures of both species and chlorophyll a in the culture ofdecreased significantly when exposed to the higher concentration (100mg/L) of GO. Basically, the synthesis of three bioactive substances in algal cells was stimulated under both experimental concentrations of GO, implying an active defense mechanism under stress. The decrease of carbohydrate content in cells ofexposed to 100mg/L GO was hypothesized as results of the conversion of energy storage materials,. from starch to neutral lipids.

graphene oxide (GO)；；；photosynthetic pigments；bioactive substances

X835

A

1000-6923(2019)11-4849-09

彭晓玲(1994-),女,山东青岛人,中国海洋大学硕士研究生,主要从事海洋污染生态效应研究.发表论文3篇.

2019-04-26

国家自然科学基金资助项目(41276104)

* 责任作者, 教授, mengfanping@ouc.edu.cn