雷帕霉素对脓毒症大鼠心肌自噬水平的影响

黎李俊，杨国辉

(贵州医科大学附属医院，贵阳550001)

脓毒症是指由感染引起的机体器官功能障碍，同时伴有多种细胞因子和炎性介质的诱导、合成和释放的综合征。超过70%的脓毒症患者死于多器官功能障碍(MODS)[1]。心脏是脓毒症主要易损靶器官之一，高达40%的脓毒症患者伴有心肌功能障碍[2]。近年研究表明，自噬是脓毒症时细胞程序性死亡的重要调节过程[3]，在脓毒症器官损伤中发挥重要作用。自噬既是清除受损细胞器对细胞具有保护作用，也是促进细胞凋亡的前体，这取决于有害刺激的强度和持续时间。我们采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症急性心肌损伤大鼠模型，用自噬促进剂雷帕霉素干预，观察心肌自噬水平的改变和脓毒症心肌损伤的关系。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 健康SPF级雄性SD大鼠54只，8～10周龄，体质量250～300 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，造模前禁食12 h，不禁水。雷帕霉素(Sigma公司，美国)，微管相关蛋白轻链3(LC3)抗体(Abcam公司，美国)，自噬接头蛋白(p62)抗体(Abcam公司，美国)。i-STAT全自动生化分析仪(mindray公司，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与模型建立 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、干预组各18只。腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，腹部正中纵行切开约1.0 cm，暴露盲肠。模型组和干预组在距盲肠末端1/2处用无菌4号丝线结扎盲肠，用20 G套管针将盲肠贯通穿孔2次，注意避开肠系膜和盲肠血管，挤出少许粪便后回纳腹腔，逐层缝合腹壁切口；假手术组仅把盲肠拉出腹腔，然后还纳腹腔。术后三组均皮下注射预热的生理盐水5 mL预防低血容量性休克，干预组给予雷帕霉素6 mg/kg腹腔注射，假手术组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射。待大鼠麻醉苏醒后送回饲养室正常饲养。

1.2.2 标本采集 术后6、12、24 h，各组分别取6只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉;开腹，腹主动脉采血5 mL，离心分离血清,保存于-80 ℃冰箱，用于检测心肌肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。取心尖部组织，用于组织形态学检查和蛋白检测。

1.2.3 血清cTnI、CK-MB水平检测 使用全自动生化分析仪检测血清cTnI、CK-MB水平。

1.2.4 心肌组织形态学检查 取大鼠心尖部，除去大血管和结缔组织，取0.5 mm3心肌组织投入10%甲醛中固定，依次行脱水、透明、包埋、切片、苏木精伊红染色后光镜下观察。

1.2.5 心肌组织自噬相关蛋白LC3、p62检测 采用Western blotting法。使用组织细胞裂解液匀浆，提取心肌组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳和湿转法将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜。分别加入LC3(1∶2 000)、p62(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记相应二抗(1∶5 000)，室温下孵育50 min，ECL化学发光显影，凝胶成像分析系统检测条带，Image J软件测量目的条带的灰度值，通过与内参条带的灰度值比较来计算目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 三组血清cTnI、CK-MB水平比较 与假手术组相比，模型组各时间点血清cTnI、CK-MB水平升高(P均<0.05)；与模型组比较，干预组各时间点血清cTnI、CK-MB水平降低(P均<0.05)。

表1 三组血清cTnI、CK-MB水平比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.2 三组心肌组织形态学比较 假手术组心肌细胞排列整齐，血管无扩张充血，未见炎症细胞浸润；模型组心肌细胞排列紊乱，毛细血管明显扩张充血，纤维变性坏死，大量炎症细胞浸润，以24 h组最为显著；干预组心肌细胞排列尚齐，可见毛细血管充血，部分炎症细胞浸润。

2.3 三组心肌组织LC3、p62蛋白表达量比较 假手术组各时间点心肌组织LC3、p62水平无明显变化；与假手术组相比，模型组各时间点心肌组织LC3、p62均升高(P均<0.05)；与模型组比较，干预组12、24 h时心肌组织LC3、p62表达升高(P均<0.05)。见表2。

3 讨论

在脓毒症致多器官功能障碍综合征中，心脏功能障碍是脓毒症中发生率比较高的脏器损伤。脓毒症心肌损伤的机制包括氧化应激与Ca2+超载、线粒体受损、缺血再灌注损伤、炎症因子对心肌的损害、氧自由基损伤、能量代谢紊乱、细胞凋亡和自噬等[4]。脓毒症时毒素入血，激活单核以及巨噬细胞和T淋巴细胞释放炎症细胞因子和趋化因子，诱导中性粒细胞大量聚集，进而释放大量促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等，对机体造成损伤的同时，形成恶性循环，进而产生全身过度炎症级联瀑布反应体系，最终导致心肌损伤[5]。cTnI、CK-MB是心肌损伤的敏感标志物，临床上常用来评估心肌损伤的程度，也是脓毒症患者判断预后的特异性和敏感标志物。本研究结果显示，模型组造模6、12、24 h时血清cTnI、CK-MB水平均高于假手术组，且随时间延长升高更加明显；而干预组各时间点血清cTnI、CK-MB水平均较模型组下降。这表明脓毒症大鼠存在心肌细胞损害，给予雷帕霉素干预后心脏的炎症反应降低，心肌损伤明显减轻。

表2 各组心肌组织LC3、p62蛋白表达量比较

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

自噬是细胞利用溶酶体降解细胞质以及受损细胞器的过程，是一种重要的防御保护机制。正常水平的自噬有助于机体及时清除衰老的细胞器和变性蛋白质，以维持细胞结构、功能和代谢的需求，维持细胞正常的生理功能[6]。在遇到感染应激情况下自噬会增强，降解受损细胞器和清除病原体，以减轻机体的炎症反应[7]。研究认为，在生理反应或轻度压力下，自噬可以促进细胞存活，是适应性的；但在严重应激情况下，自噬不足导致大量有害物质堆积，最终造成细胞死亡[8]。自噬主要包括以下过程：杯状双层分离膜的形成，杯状双层分离膜延伸包裹受损细胞器，杯状双层分离膜闭合形成自噬体，自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，自噬溶酶体降解[9]。自噬相关蛋白LC3和p62是自噬体膜的标志蛋白，贯穿自噬体形成的始终，其表达增加提示自噬体形成。本研究结果显示，模型组和干预组心肌组织均可见LC3、p62表达，干预组12、24 h时心肌组织LC3和p62蛋白表达水平较模型组升高，且24 h高于12 h；而模型组和干预组6 h时心肌组织LC3和p62蛋白表达水平无统计学差异。这提示脓毒症时心肌因炎症刺激、微生物入侵导致心肌细胞受损，并激活了自噬。雷帕霉素是自噬促进剂，通过抑制mTOR信号通路促进自噬的发生。研究表明，激活自噬可抑制细胞炎性凋亡，减少炎症因子产生[10]。本研究结果显示，模型组造模6 h即有自噬发生，而经过雷帕霉素干预后，自噬相关蛋白LC3和p62明显升高，且心肌组织中炎性细胞浸润减少，血清cTnI、CK-MB水平降低，说明炎症反应被抑制，进一步说明雷帕霉素可促进心肌自噬的发生，有利于改善脓毒症所致心肌损伤。

综上所述，脓毒症早期即可见心肌组织中自噬的发生，雷帕霉素通过促进自噬的形成，有利于清除受损细胞器和减轻脓毒症心肌组织的炎症反应，从而减轻脓毒症所致的心肌损伤。