血培养奥默柯达酵母鉴定方法学比较及药物敏感性
2019-11-27周梦兰于淑颖徐英春
周梦兰，于淑颖，肖 盟，徐英春
近年来，侵袭性真菌病（IFD）的发病率不断增高，逐渐成为导致住院患者高发病率和病死率的重要原因之一，给患者的预后和生命安全带来很大的威胁[1-2]。真菌血症已成为医院感染性疾病的第四大病因，总体病死率高达 40%，而且大大增加医疗支出[3-5]。尽管白念珠菌（Candida albicans）依然是引起IFD的主要病原菌，但是近年来IFD中非白念株菌如近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、热带念珠菌（Candida tropicalis）及其他少见酵母如奥默柯达酵母（Kodamaea ohmeri）等的检出率也在逐渐增高[6-7]。
本研究基于CHIF-NET监测数据，对2010－2016年7年间血培养分离的奥默柯达酵母的流行病学数据及药物敏感性进行分析总结。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
选取我国多中心侵袭性真菌监测项目CHIFNET 2010－2016年连续7年收集的奥默柯达酵母，在中心实验室进行复核鉴定及药物敏感性检测，对其流行病学数据进行分析。
1.2 方法
1.2.1 菌株复核鉴定 所有菌株均在沙保弱培养基上进行复苏、传代及分纯。菌株鉴定以26S rDNA测序为金标准[8]，分别评估了法国生物梅里埃公司的VITEK 2-Compact、VITEK MS和德国布鲁克公司Bruker MS的鉴定性能。对Bruker MS，本课题还同时进行了直接涂布法和甲酸-乙醇蛋白提取法两种前处理方法结果的比较。质谱鉴定具体操作遵照仪器使用说明。VITEK MS判定标准：可信度为绿色方框（可信度60.0%～99.9%）的为鉴定至种水平，黄色三角的为低分辨率，红色圆圈的为无鉴定结果。Bruker MS判定标准：鉴定分值≥2.0为鉴定至种水平，1.7≤鉴定分值＜2.0为鉴定至属水平，鉴定分值＜1.7的为无准确鉴定结 果。
1.2.2 菌株原始鉴定 基于复核鉴定结果，对所有奥默柯达酵母的原始鉴定结果进行回顾性分析、总结。各参加单位所使用的原始鉴定方法主要包括VITEK 2-Compact、VITEK MS、ATB 32C、APC 20C以及CHROM agar显色平皿。
1.2.3 抗真菌药物敏感性检测 参照CLSI 标准，采用标准微量肉汤稀释法（BMD）检测8 种常用抗真菌药物：氟康唑（0.25～256 mg/ L）、伏立康唑（0.015～16 mg/L）、伊曲康唑（0.015～16 mg/ L）、泊.康 唑（0.015～16 mg/ L）、.泊.净（0.008～8 mg/ L）、.卡.净（0.008～8 mg/ L）、5-.胞.啶（0.064～64 mg/ L）、.性.素B（0.015～16 mg/ L）的最低抑菌浓度（MIC）值[9]。抗真菌药物标准粉均购自中国食品药品检定研究 院。
2 结果
2.1 菌株分布
2010－2016年，CHIF-NET监测网共收集到34株来自全国12个省份16所医院血培养阳性患者分离的非重复奥默柯达酵母。其中2016年分离19株，占所有菌株的55.9%。该菌感染患者中男20例，女14例，分别占58.8%和41.2%。患者分布科室中外科占47.1%（16/34），其次为内科23.5%（8/34）、重症监护室14.7%（5/34）、儿科8.8%（3/34）、急诊科2.9%（1/34）和器官移植科2.9%（1/34）。
2.2 26S rDNA复核鉴定及评估
34株奥默柯达酵母26S rDNA测序结果经与GenBank比对，与标准株CBS 6722相似度达99% ～100%。三种表型鉴定方法比较结果显示：VITEK 2-Compact及VITEK MS分别可将94.1%（32/34）和100%（32/32）的菌株鉴定到种水平。Bruker MS直接涂布法及甲酸-乙醇提取法的种水平鉴定率分别为8.8%（3/34）、97.1%（33/34），属水平鉴定率分别为67.6%（23/34）、2.9%（1/34）。见表1。
2.3 26S rDNA复核鉴定和原始鉴定比较
34株经26S rDNA复核鉴定为奥默柯达酵母与当地医院的原始鉴定的结果比较见表2，原始鉴定结果中仅有58.8%（20/34）的菌株被当地医院准确鉴定为奥默柯达酵母。其余14株奥默柯达酵母被VITEK 2-Compact、APC 20C、ATB和CHROM agar显色平皿错误地鉴定为白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌等其他念珠菌种。
2.4 药物敏感性
因目前CLSI/EUCAST均尚无奥默柯达酵母折点，故对BMD检测8种抗真菌药物的MIC50、MIC90及MIC范围归纳于表3。由表可见，除氟康唑MIC90高达16 mg/L外，其余7种抗真菌药物对奥默柯达酵母均呈现良好的体外抗菌活性，MIC90为0.25～1 mg/L。
表1 34株血培养阳性奥默柯达酵母VITEK 2-Compact、VITEK MS和Bruker Biotyper MS鉴定结果比较Table.Performance of VITEK 2-Compact，VITEK MS and Bruker Biotyper MS compared with ITS gene sequencing in identification of 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture
3 讨论
奥默柯达酵母，原名奥默毕赤酵母（Pichia ohmeri及Yamadazyma ohmeri），是一种产子囊孢子酵母，最初从腌制蔬菜或腐烂水果中分离到，因其发酵作用而广泛应用于食品加工产业[10]。奥默柯达酵母归属于柯达菌属，除奥默柯达菌种外还包含其他4个种（K.anthrophila、K.kakaduensis、K.laetipori和K.nitidulidarum），据现有报道仅奥默柯达酵母对人类有致病性[10]。但奥默柯达酵母并不是临床常见的致病菌，该菌于1984年首次在胸水标本中分离到，在当时被认为是污染菌或是无害的定植菌。自从1998年首例报道奥默柯达酵母引起的菌血症以来[11]，各种由奥默柯达酵母引起的IFD逐渐增多，包括脓毒症或真菌血症[12-13]、导管相关血流感染[14-15]、腹膜炎[16]、心内膜炎等[17-18]，病死率较高。另有研究报道奥默柯达酵母在儿科病房引起暴发性医院感染[19]。
本研究首次对多中心阳性血培养分离的奥默柯达酵母进行菌种复核鉴定和抗真菌药物敏感性数据分析总结。质谱作为新兴的快速病原菌鉴定方法，在临床微生物实验室得到广泛的使用。但由于奥默柯达酵母目前仍然分离较少，现有研究仍主要集中于个案报道，菌株鉴定大多使用基因测序的方法进行。目前仅有一篇文章报道显示使用Burker MS甲酸-乙醇提取法对奥默柯达酵母进行准确鉴定[14]，因此本研究对多中心分离的奥默柯达酵母进行了不同表型鉴定方法的性能比较。相比较而言，VITEK 2-Compact及VITEK MS对奥默柯达酵母的鉴定效果较好；而Burker MS因样品前处理方法的不同鉴定效果相差较大，甲酸-乙醇提取法的鉴定效果远优于直接涂布法。回顾当地医院的原始鉴定结果发现，34株奥默柯达酵母中仅有20株被正确鉴定，正确率为58.8%（20/34）。有6株奥默柯达酵母分别被CHROM agar显色平皿鉴定为白念珠菌（n=3）、热带念珠菌（n=2）、光滑念珠菌（n=1），显示鉴定结果完全错误。因奥默柯达酵母菌落颜色随孵育时间的延长会出现特征性粉色到蓝色菌落变化，菌落颜色的完全转换可能需要1周时间[20]。而CHROM agar显色平皿主要通过平皿颜色变化判断结果，因此判读过早或过晚均会导致判断失误，同时本研究在使用CHROM agar显色平皿进行鉴定时可能需要持续进行2～5 d菌落颜色变化观察。与印度单中心血流分离的奥默柯达酵母研究类似，除氟康唑外，本研究中分离的奥默柯达酵母对其他7种抗真菌药物呈现良好的体外活性，提示其体内治疗可能有效[21]。
表3 34株血培养阳性奥默柯达酵母体外抗真菌药物敏感性Table.In vitro antifungal susceptibility of antifungal agents against 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture
综上，本研究显示，在引起IFD的病原中，奥默柯达酵母相对罕见，但感染病例的增加提示我们必须对其引起重视，早期准确快速鉴定及抗真菌药物敏感性检测对其感染治疗至关重要。
