肠杆菌科细菌质粒介导氨基糖苷类耐药基因研究进展

施清喻，胡付品

作者单位： 复旦大学附属华山医院抗生素研究所，国家卫健委临床药理重点实验室，上海 200041。

氨基糖苷类抗菌药物（aminoglycosides）通过结合原核生物30S核糖体亚基16S rRNA的高保守A位点，干扰细菌蛋白质的合成导致细菌的死亡[1]，现用于临床革兰阴性菌所致严重感染的治疗及畜牧业中。按其作用部位可分为：①与A位点结合，4，6-二取代脱氧链霉胺类（如卡那霉素和庆大霉素）；4，5-二取代脱氧链霉胺类（如新霉素）。②非与A位点结合（如链霉素和大观霉素）[2]。

但氨基糖苷类抗菌药物由于其不良反应，且随着广谱抗生素的出现，临床应用逐渐减少。近年多重耐药肠杆菌科细菌不断出现，但首选治疗药物碳青霉烯类耐药性却逐年上升。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）被列为三大最紧迫的抗菌药物耐药威胁之一。现推荐的CRE感染治疗方法是单用或联合用氨基糖苷类、替加环素、黏菌素和新开发的头孢他啶-阿维巴坦（avycaz）[3]。其中氨基糖苷类的治疗失败率较低[4]，且随着国家监管力度的增强其使用安全性也得到了提高。但随着临床应用，氨基糖苷类的耐药性逐年上升。其中会导致氨基糖苷类广泛高水平耐药的16S rRNA需要引起临床警惕，现就其基因环境及表达调控研究进行综述。

1 质粒介导16S rRNA甲基化氨基糖苷类耐药机制

氨基糖苷类的常见耐药机制有：①细菌的细胞膜通透性改变、内膜转运降低及主动外排加强。②细菌的核糖体蛋白、16S rRNA突变导致抗菌药物作用靶位改变。③细菌产生氨基糖苷钝化酶，这是最常见的一种机制。氨基糖苷钝化酶包括N-乙酰转移酶（aminoglycoside acetytransferase，AAC）、O-腺苷转移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT； aminoglycoside adenylase，AAD） 和O-磷酸转移酶 （aminoglycoside phosphotransferase，APH）。钝化酶的修饰钝化作用具有底物专一性，但存在双功能钝化酶，如AAC（6'）-APH（2"）酶可同时作用于6'位氨基和2"位羟基。这种酶在金葡菌、肠球菌中较为多见，在革兰阴性菌中罕见。

氨基糖苷类抗菌药物是由链霉菌属、 小单孢菌属等放线菌产生的，这些放线菌通过产16S rRNA甲基酶形成耐药。根据甲基化的位点可将氨基糖苷类耐药酶分为两类：①A1408的N1位点甲基化，发现于产天神霉素的链霉菌属，主要包括KgmB、NbrB、Kmr，导致对卡那霉素和安普霉素耐药，但对庆大霉素敏感；②G1405的N7位点甲基化，发现于产庆大霉素绛红小单孢菌，主要包括Grm、Sgm、FmrO，导致对卡那霉素和庆大霉素耐药，对安普霉素敏感。两者均作用于16S rRNA的A位点，它们的甲基化会阻止肽酰tRNA由A向P位点的转移，干扰蛋白质翻译[1]。

这一机制原不存在于临床分离株中，但自2003年起，这种酶出现在临床菌株中[5-6]。16S rRNA甲基化酶通过使16S rRNA的A位点特定核苷酸的甲基化，阻碍氨基糖苷类药物与核糖体30S亚基结合，导致耐药。先发现的ArmA、RmtA～RmtH作用于G1405位点，破坏与4，6-二取代脱氧链霉胺的结合[7]。而NpmA作用于A1408位点，同时阻碍了4，5-和4，6-二取代脱氧链霉胺[2]。除了会导致多种氨基糖苷类高水平耐药，16S rRNA甲基化酶位于可移动的质粒或转座子上易于传播，需引起广泛关注。

2 肠杆菌科质粒介导16S rRNA甲基化酶基因相关研究

现已发现10组甲基化酶：ArmA、RmtARmtH、NpmA[8]，见图1。2002年首次检测出16S rRNA甲基化酶[9]，2003年，Galimand等[5]发现其为ArmA。armA基因多位于可转移质粒的复合转座子上，后发现也可存在IS26或ISAba125复合转座子相关的独立环状结构，与宿主质粒共存[10]，仍不明确其确切起源。同年发现的RmtA，其基因位于接合型质粒中的耐汞转座子Tn5041上，在移动元件κ-γ的两个拷贝之间，该基因可能源于产氨基糖苷放线菌[11]。2004年，Doi等[12]发现RmtB，其基因与rmtA核酸序列相似性高。ArmA和RmtB是世界范围报道最多的16S rRNA甲基化酶，虽然两者都易携带blaCTX-M，但rmtB与blaCTX-M位于不同的质粒[13]。2006年在奇异变形杆菌中发现RmtC[14]，与之前发现的16S rRNA甲基化酶相似性不高。RmtC的检出率在一些地区仅次于ArmA和RmtB[15]。2007年，在巴西分离出同时产SPM-1金属酶和RmtD的细菌[16]，在几年后又发现了rmtD2[17]与rmtD3[18]基因型。现RmtD相关报道主要集中于巴西，且有一定概率同时产SPM-1[19]。2010年RmtE首次分离自牛源性大肠埃希菌[20]，后在2013年于人体分离出[21]，5年后发现rmtE2基因型[22]，至今相关报道依旧十分罕见。2011年，在法国发现了RmtF，与RmtD编码蛋白一致性较高[23-24]，其可能与放线菌的16S rRNA甲基化酶存在亲缘关系[25]。2011年在巴西筛选出 5株产RmtG细菌，这5株均同时产CTX-M，有4株产KPC-2[26]。早先RmtG的报道主要在美洲[27]，2018年首次在欧洲出现[28]。2 年后检测出RmtH[29]，该菌株同时携带blaCTX-M-15、blaSHV-1、blaOXA-1[30]。2007年发现了卡那霉素-阿泊拉霉素甲基转移酶（Kam）家族的NpmA[2]。NpmA可能拥有m（1）A1408和m（1）G1408的双重活性[31]。现在产NpmA的菌株依旧较为罕见。现已发现16S rRNA甲基化酶基因的相关研究见表.[32-45]。

图1 革兰阴性菌和放线菌16S rRNA甲基化酶无根树图

3 质粒介导16S rRNA甲基化酶氨基糖苷类耐药的临床策略

氨基糖苷类抗菌药物适合作为治疗CRE的联合用药，特别是新一代氨基糖苷类plazomicin，在体外对多药耐药肠杆菌科细菌具有杀菌活性，包括产生广谱β内酰胺酶[46]、碳青霉烯酶[47]和大多数氨基糖苷钝化酶[48]类细菌。但其体外活性会受16S rRNA甲基化酶的影响[48]。需警惕携带16S rRNA甲基化酶基因的CRE越发频繁地出现。

而质粒介导16S rRNA甲基化酶作为氨基糖苷类新发现耐药机制，虽未暴发性流行，但却呈全球分布的趋势。而在中国国内，2004年首次在台湾出现ArmA的相关报道[49]，后在2012年国内分离出了RmtB[50]，它们是国内分离率最高的2种16S rRNA甲基化酶。近年又分别检出了RmtE[51]、NpmA[25]、RmtA[52]。需要警惕的是，由于氨基糖苷类药物在兽医学中的广泛运用，动物中出现了产16S rRNA甲基化酶的致病菌株[9，43]，可能通过食物向人类传播。

表1 16S rRNA 甲基化酶相关基因

此外16S rRNA甲基化酶由于其耐药特性，也需临床的充分重视。其一，16S rRNA甲基化酶会介导革兰阴性杆菌对大多数临床常用氨基糖苷类抗菌药物极高水平耐药，且无法通过提高剂量纠正。其二，所有已知的16S rRNA甲基化酶的结构基因均位于可转移的质粒，且与可移动遗传因子相关联，导致水平传播。其三，这些细菌易发展为多重耐药，尤其是与各种β内酰胺酶基因联合耐药。所以尽早筛选出16S rRNA甲基化基因对临床的预防和治疗相当重要。

在检测16S rRNA甲基化酶时，较易与产多种钝化酶的细菌混淆，且两者可同时存在。卡那霉素的衍生物阿贝卡星可抵抗钝化酶的作用，仅少数产双功能酶可导致耐药，若其高水平耐药则怀疑产16S rRNA甲基化酶。有建议当出现对所有氨基糖苷类药物耐药的肠杆菌科细菌、不动杆菌或铜绿假单胞菌时，先进行庆大霉素、阿米卡星的纸片扩散法药敏试验，若可获得阿贝卡星也应检测，确认无抑菌圈后进行多重PCR，以此检测16S rRNA甲基化酶基因[6]。

当在临床遇到产16S rRNA甲基化酶革兰阴性菌时，应该高度关注其抗菌谱，可筛选是否产超广谱β内酰胺酶（ESBL）。当接触高度疑似或确诊产16S rRNA甲基化酶和ESBL或产金属β内酰胺酶细菌感染的患者时，需采取一定的接触预防措施。

4 结语

虽然人们还未明确16S rRNA甲基化酶的来源，但由于其可介导多数氨基糖苷类抗菌药物高水平耐药，基因结构可移动性且易形成多重耐药的特性，使其成为临床治疗的严重问题。截止目前，在世界各地纷纷出现了产16S rRNA甲基化酶细菌，在我国也出现了相应报道。不同地区产酶基因的分布情况存在较大差异，可在相应地区进行流行病学调查，分析其传播途径，揭示其基因环境，这将对临床治疗与药物研发提供帮助。对于医务人员和流行病学工作者，早期筛查携带该基因的病原菌，加强对此类耐药菌株的监控，以防止其广泛传播至关重要。