斑马鱼定向筛选在水体化学风险因子鉴别中的应用

2019-11-26杨方星

水生生物学报 2019年6期

王申杨方星

(浙江大学环境与资源学院环境健康研究所, 杭州 310058)

水资源是我们生活的重要组成部分, 工业、农业以及人们的日常生活都离不开水。随着社会的发展和人类活动的加剧, 地球上的水资源受到了不同程度的污染。影响水体安全的因素可以分为物理因素、化学因素、生物因素。而化学因素是研究的热点内容。当大量人工合成的化学物质进入水体时, 就会对水生生物和人类的健康产生潜在的威胁[1—7]。据报道, 水体污染可以造成鱼类甲状腺干扰效应[8], 也会导致儿童神经系统发育缺陷[1]。

水体的不安全表现为水体对生物的毒性效应,而这些毒性效应是由水体中存在的风险因子产生的, 保障水体安全, 就是要控制其毒性效应, 本质上就是要控制产生这些毒性效应的风险因子。通过以往的研究, 人们已经鉴别出了水体中许多具有毒性效应的化合物, 并建立了受监控化合物库(就是我们通常说的各种标准里的监测指标), 以此来评价水体的安全性。但是, 仅仅监测这些受监控的化合物并不能够全面地指示水体的安全, 而且常常忽略可能造成风险的潜在物质。随着技术手段的发展, 人们能够检测的化合物数量越来越多, 浓度也越来越低, 也发现了在现有受监控化合物库之外的一些化合物具有毒性效应, 能够影响水体安全。因此, 这些物质也逐渐被加入到受监控的化合物名单中。随着监控化合物名单变的越来越大, 分析成本也越来越高。因此为了全面地反映水体健康风险的真实情况, 更好的方法是在毒性实验的基础上,对水体中的化合物进行全谱检测, 尽可能多地筛选水体中的风险因子, 来指示水的安全。目前全谱检测主要的实现途径就是基于高分辨质谱对样品中的已知化合物进行定向筛选(Target screening), 对样品中的未知化合物进行非定向筛选(Non-target screening)[9]。高通量定向筛选是预先设定想要研究的大量化合物, 然后探究样品中是否存在这些化合物, 而非定向筛选是在没有预先设定化合物的基础上, 基于仪器得到的谱图来推断样品中可能存在的化合物[10,11]。非定向筛选由于其缺少化合物的信息, 鉴定物质是相对来说较为困难。

斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)是毒性研究中常用的一种模式生物。它对水质和食物的要求不高,在25—31℃发育正常。斑马鱼因其具有遗传背景清晰, 体型小, 易于饲养和管理, 发育速度快, 生殖周期短, 繁殖能力强, 胚胎发育快, 胚胎的透光性好等优势, 被国际经济合作组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)列为测试的推荐实验物种, 在环境毒理学中被广泛应用于神经毒性[12]、生殖毒性[13]、内分泌干扰作用[8,14]等研究。

在本研究中, 我们采集了我国东部某医药产业基地河流的水体样品, 在斑马鱼暴露测试的基础上,利用高通量定向筛选方法对水样进行分析, 鉴别样品中的主要化学因子及其与斑马鱼暴露实验的相关性, 以此揭示影响该河流中水体安全的主要化学风险因子。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究选择的河流位于我国东部某省, 该河流所在区域是当地重要的医药产业基地。从上游至下游分别设置了7个采样点, 分别代表了源头(采样点1)、农业源支流(采样点2)、农业源汇流(采样点3)、工业区下游(采样点4)、工业区汇流(采样点5)、生活区下游(采样点6)、入河口(采样点7, 该河流在此汇入另一条较大河流)。具体采样点地址如图 1所示。水样的采集参照GB 12998-91中地表水采样技术指导。每个采样点取适量河水, 存放在4 L的样品瓶中, 利用冰袋转移至实验室并4℃保存,使用时将其恢复至室温。

1.2 斑马鱼暴露实验

模式生物培养斑马鱼购自当地花鸟市场,约4月龄。在暴露实验前, 斑马鱼饲养在恒温(26±1)℃且恒光照(光照: 黑暗为14h:10h)的鱼房中,在除氯水中驯化5d, 每天喂食丰年虫1次, 并及时清理食物残渣和粪便。

暴露实验实验设置暴露组和对照组, 对照组用除氯水, 暴露组分别为7个采样点的河水。每组12条斑马鱼, 暴露在2 L的大烧杯中。暴露时间为8d, 暴露期间, 每天喂食1次, 每2d更换装置内一半的水, 对照组补充除氯水, 暴露组添加相应的河水。

1.3 高通量定向筛选

标准化合物的配制选取生产生活中常用的医药、农药、兽药、食品添加剂、表面活性剂、工业原料等248种标准物质作为定向筛选的物质, 其中药物包括米氮平(Mirtazapine)、氯氮平(Clozapine)、氧氟沙星(Ofloxacin)等; 农药包括苯锈啶(Fenpropidin)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、阿特拉津(Atrazine)、异丙甲草胺(Metolachlor)等; 兽药包括恩诺沙星(Enrofloxacin); 食品添加剂包括抑霉唑(Imazalil)、安赛蜜(Acesulfame)等; 表面活性剂包括月桂酰胺丙基甜菜碱(Lauramidopropyl betaine)等; 工业原料包括对甲苯酰磷酸酯(Tri-p-cresyl phosphate)等。具体成分如附表 1所示。先将各标准物质用纯甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL的混标溶液(各标准物质的浓度均为1 mg/mL), 然后将混标溶液用甲醇稀释成100 ng/mL的工作溶液, 利用UPLC/ESI-Q-TOF-MS对该标样进行分析, 建立定向筛选的分析列表。

水样的准备将水样过0.2 μm的水相膜, 进入UPLC/ESI-Q-TOF-MS进行分析。

仪器分析条件样品的分析使用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC/ESI-QTOF-MS, AB Sciex 5600+, 美国)。液相分离色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1 mm×150 mm×1.8 μm,柱温为25℃。进样量为10 μL。色谱分离采用水/甲醇(A: 水, B: 甲醇, 均含0.1%甲酸)二元溶剂洗脱, 洗脱梯度为: 0 90%A, 4min 90%A, 26min 0A, 50min 0A, 51min 90%A, 52min 90%A。流速0.2 mL/min。质谱扫描范围100—1500 amu, ESI正离子模式, 离子源电压5.5 kv, 离子源温度600℃。

图1 各采样点图Fig. 1 Map of sampling sites

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼暴露测试

可以看出, 经过8d的暴露, 各个取水点的斑马鱼均有不同程度的死亡情况(表 1), 而对照组却全部存活。总的来说, 下游死亡率较上游高。

表1 斑马鱼暴露测试死亡率Tab. 1 Death rates of zebrafish exposed to the river water

2.2 高通量定向筛选列表的建立

首先在软件中建立含有248种物质名称和化学式的初始列表, 得到符合一级质谱图的物质列表,然后打开一种物质的色谱图, 选中该保留时间下的色谱峰, 观察有无合理的同位素峰分布以及相应的[M+H+]+峰, 再打开该物质的二级质谱图, 与结构式图进行匹配, 记录下每种物质的匹配率。以异丙甲草胺为例, 过程如图 2所示。异丙甲草胺带一个单位正电荷的准分子离子峰的质荷比为284.14118, 而仪器在23.165min时检测到一个质荷比为284.14146(相对质量误差为1 ppm, 即百万分之一)的质谱峰(图 2a)。再打开保留时间为23.165min时的一级质谱图, 可以观察到明显的[M+H+]+峰及其相应的同位素峰, 还有[M+Na+]+峰及其相应的同位素峰。然后打开该离子峰的二级质谱图, 并在chemicalbook网站上查找异丙甲草胺的结构式图, 在软件中将二者进行关联后, 软件会计算出该结构式可能产生的碎片离子, 并与二级质谱产生的峰相匹配, 结果显示匹配率为100%, 具体匹配结果如图 2c所示。

将混标溶液用甲醇配制成浓度梯度为100、50、10、5、1、0.5和0.1 ng/mL的标准溶液系列,在相同条件下进行检测, 计算出其标准曲线方程。在物质鉴定完毕后, 记录每种物质的保留时间, 即得到定向筛选的分析列表。各物质在其浓度范围内线性相应较好(绝大部分R2＞0.9, 个别几种化合物0.85 ＜R2＜ 0.9), 可以用于精确定量。

2.3 水样的定向筛选

首先打开一个样品数据, 然后打开建立的定向筛选列表, 软件会按照列表中物质的一级离子质荷比和相应的保留时间进行筛选, 保留MS误差在10 ppm以内的物质, 然后进行同位素峰以及二级离子验证, 并根据标准曲线计算物质的浓度水平。以阿奇霉素为例, 鉴定过程如图 3所示。阿奇霉素(Azithromycin)标准物质形成的准分子离子质荷比为749.5158, 保留时间为15.77min (图 3a), 而软件在15.79min处检测到一个质荷比刚好为的749.5158的离子峰(图 3b)。该离子峰可能为阿奇霉素形成的准分子离子峰。然后观察到质荷比为749.5158的离子峰存在明显的同位素峰, 其[M+H+]+峰也存在明显的同位素峰(图 3c)。接着打开该离子峰下的二级质谱图, 并在chemicalbook网站上查找该物质的结构式图, 在软件中将二者进行关联后, 结果显示二级质谱的匹配率为100%, 具体匹配结果如图 3d。

各采样点检测到的物质及浓度如表 2所示。在该河流中共鉴别出24种化合物, 但各采样点检出的化合物数量并不一致, 采样点1—7分别检出24、24、24、21、21、21和20种化合物。检出的化合物以药物为主, 其中包含了17种药物, 如米氮平、地氯雷他定等。这可能是由于当地有许多医药企业, 药物组分通过污水排放、大气沉降等各种途径进入河流后残留在水体中。此外, 检出化合物的浓度从上游到下游基本呈现出减小的趋势,可能是由于该河流在向下游流动的过程中, 有多个小支流汇入, 导致径流量增大, 从而起到了一定的稀释作用。

2.4 水体风险因子鉴别

将各个水样中所检出的24种化合物的浓度与暴露实验中斑马鱼的死亡率分别进行关联, 并用origin软件进行线性拟合, 记录其线性方程y=a+bx中的斜率b, 相关系数R2以及显著性分析P(表 3)。

在定向筛选中鉴定出来的24个化合物的浓度与斑马鱼死亡率均不呈正相关, 因此我们认为, 河水中检出的化合物可能不是造成斑马鱼死亡的主要原因。此外, 由于缺乏检出化合物对斑马鱼的毒性数据, 无法定量评价检出化合物对斑马鱼死亡的毒性贡献。

3 总结

我国东部某医药产业基地河流水样对斑马鱼进行暴露实验后, 斑马鱼出现有不同程度的死亡。高通量定向筛选鉴定出了水样中以药物成分为主的24种化合物, 但这些化合物的浓度水平无法完全解释斑马鱼暴露实验的结果。因此, 我们推断, 鉴定出的药物组成不是该河流水体健康风险的主要因子。

本研究主要考虑水体中极性有机污染物对斑马鱼的毒性效应, 并未考虑水体的理化参数, 比如溶解氧等以及其他无机污染物, 如重金属等的毒性贡献。在接下来的研究中, 可以考虑对水样的理化参数以及水样中的金属离子含量进行检测,也可以利用非定向分析对样品中的化合物进行解析, 以进一步揭示该河流中造成斑马鱼死亡的主要毒性因素。

图2 混合标样中异丙甲草胺的鉴定Fig. 2 Identification of metolachlor in standard mixture

图3 水样中阿奇霉素的鉴定Fig. 3 Identification of azithromycin in water sample

表2 水体样品中鉴定出的化合物Tab. 2 Compounds identified in the river water

表3 水样中检出的24种化合物浓度与斑马鱼死亡率的相关性Tab. 3 The relationship between the concentrations of all compounds detected in the water samples with the death rates of zebrafish in the exposure experiment