大口黑鲈池塘工程化循环水养殖系统的溶解氧时空变化及菌群响应特征

王 朋 徐钢春 徐 跑,

(1. 南京农业大学无锡渔业学院, 无锡 214081; 2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室, 无锡 214081)

池塘工程化循环水养殖系统(In-pond Raceway System, IPRS)由奥本大学和美国大豆协会设计并推广。该系统以“大面积净水, 小面积养鱼”为特色,资源节约、环境友好, 兼顾经济效益与社会效益,具有传统池塘养殖所没有的诸多优势。在IPRS中进行高密度精养, 所有水槽通过流水共用同一水体。因此, IPRS中水体菌落变化也将与传统养殖池塘不同。

大口黑鲈(Micropterus salmoides)原产于美国,在20世纪80年代引入中国, 由于其肉质鲜美营养丰富而受到消费者青睐, 市场广阔, 但是近年来鱼病频发让养殖户损失惨重[1]。其中, 多种细菌引起的继发感染是造成重大损失的主要原因[2]。此外, 研究表明水体和底泥中的菌群还会影响肠道菌落结构[3]。因此, 研究水体菌群变化对水产养殖中的疾病预防和生态调控具有重要意义。

高通量测序技术作为成熟有效的技术手段, 已经成为鉴别分析细菌群落的主要方式[4]。其优势主要在于可以不经过分离纯化就可以全面、精准地分析细菌的种类和相对丰度[5]。在过去的研究中,高通量测序技术被广泛应用于土壤、底泥、水体和肠道菌群的研究[6]。本实验对IPRS中溶解氧(Dissolved oxygen content, DOC)和菌群的时空变化研究, 以期为水产品健康养殖和水体生态调控提供更多科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

IPRS 位于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心扬中实验基地(图 1), 水体面积为58 m×666 m。水槽规格为25 m×5 m×2.5 m(分别对应长、宽、高), 共12套。2017年6月中旬, 低、高密度水槽各放入15000尾和25000尾大口黑鲈(均重10 g), 由工人负责投喂和日常管理。7—11月份, 每月月初采样, 沿水槽对角线的两顶点, 从不同深度(0.5、1和1.5 m)处取等量水体并在水桶中混合均匀, 盛取500 mL作为样本。粪便收集区取样方案类似。在昼夜变化中, 在DOC最高和最低时分别取样并用便携式溶氧仪[哈希水质分析仪(上海)有限公司]测量溶解氧。对采集到的水体样本进行编号, 以便后续处理。编号第一位数字代表月份, 第二位数字代表密度, “4”代表低密度组, “5”代表高密度组。编号第三位代表DOC, “1”代表DOC最高, “2”代表DOC最低。第四位数字代表不同区域, “1”代表养殖区,“2”代表粪便收集区。如: 样本编号“7-411”, 代表7月份低密度组DOC最高时养殖区样本, 依此类推。待1次采样完成后, 在4℃的条件下以12000 r/min的转速离心8min, 保留沉淀。上清液用孔径0.22 μm 的滤膜抽滤, 将滤膜和沉淀在2 mL的离心管内混合, 作为送检样本并暂存于-80℃的冰箱中。

1.2 样本DNA提取、PCR扩增及高通量测序

待所有样本处理完毕, 送至美吉生物科技有限公司(上海), 对16S rDNA 基因V3-V4区进行PCR扩增, 引物序列为338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)。进行基于Illumina Miseq测序平台的高通量测序。测序数据经过过滤、拼接后将有效序列返回。

1.3 数据分析

利用美吉I-Sanger云平台(Usearch Vsesion 7.0)对样本有效序列进行聚类分析, 默认将具有97%一致性的有效序列聚类为同一操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTU)。通过将构建OTU时选取的代表序列与Silva (Release128)和Greengene (Release 13.5)数据库进行比对, 对OTU进行注释, 在结果分析中将OTU视为一种细菌。为了消除样本因序列数不同引起的差异, 以序列数最少的样本为依据, 对所有样本进行均一化处理(Cutoff=241908), 并以处理后的数据为基础进行后续的多样性分析。采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 当P＜0.05时, 说明不同分组之间差异显著。采用Person相关分析方法分析优势菌群与DOC和水温之间的相关性,r表示相关系数, *表示相关性显著(P＜0.0.5),**表示相关性极显著(P＜0.01)。

2 结果

2.1 测序结果

40个样本共得到1441319个有效序列, 并聚类于41门、629属、1928个OTU (表 1)。其中, 657个OTU为7—11月份所共有。测序深度均在98.8%以上, 证明所有样本中菌群多样性均被有效覆盖。

2.2 7—11月份细菌群落丰度变化

当DOC最高时, sobs指数在低、高密度组中养殖区和粪便收集区的变化趋势类似(最大值出现在9月, 最小值在10月)。粪便收集区的菌群丰富度整体高于水槽养殖区, 且在9月和11月, 低密度组的菌群丰富度明显高于高密度组。当DOC最低时, 菌群丰富度在养殖区的变化趋势与DOC最高时一致, 但在粪便收集区的菌群丰富度受到巨大影响, 菌群丰度最高值出现在8月(低密度组)和11月(高密度组),且其最高丰度明显低于养殖区。在9月之外的其他月, 粪便收集区的菌群丰富度普遍高于养殖区, 且数量差异明显(图 2)。

图1 IPRS系统及流水槽结构示意图Fig. 1 Sketch of IPRS and aquaculture channel

在DOC最高时, 养殖区和粪便收集区及DOC最低时养殖区的菌群丰富度具有相同的变化趋势(最高值在9月, 最低值在10月)。在粪便收集区、DOC最低时, 低密度组的菌群多样性在9月最高, 而高密度组则是11月, 这与菌群多样性季节变化的整体趋势明显不同。综合来看, 菌群丰富度最高值出现在9月、粪便收集区、DOC最高时; 最低值出现在10月、养殖区、DOC最高时。在7—11月份的季节变化中, 高密度组的菌群丰度变化幅度小于低密度组, 且高、低密度组皆在粪便收集区、DOC最低时变化幅度最小(图 3)。

表1 高通量测序结果分析

Tab. 1 The results of the high-through sequencing analysis

样本Sample 有效序列Effective reads测序深度Goods coverage七月July 323358 1208 0.991八月August 308630 1367 0.990九月September 305065 1654 0.988十月October 262358 1156 0.991十一月November 241908 1192 0.992有效OTUEffective OTU

从整体上看, 除低密度组在9月、粪便收集区外, 同一区域中DOC最低时的菌群丰富度普遍高于DOC最高时, 且菌群丰富度在低密度组中的变化幅度明显高于高密度组。这表明在昼夜变化中, 菌群丰富度可能与DOC存在负相关关系。在低密度组的粪便收集区, 菌群多样性在9月份的昼夜差异巨大, 除DOC较低外, 还可能受水温影响(图 4)。

以上结果表明, 粪便收集区的菌群丰富度普遍高于养殖区, 且当DOC最低时差异更加明显。除9月粪便收集区外, 菌群多样性在低密度组中的变化幅度明显高于高密度组。

2.3 基于门水平的菌群变化

在7—11月份的季节变化中, 相对丰度前四的细菌分别是: 变形菌(Proteobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)和蓝细菌(Cyanobacteria), 且它们在不同月份中的变化情况各不相同(图 5)。

图2 Sobs指数在低、高密度组不同区域中的变化Fig. 2 Sobs index variation in different areas of low and high stocking density channel

在DOC最高时, 变形菌在7、9、11月养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区。当DOC最低时, 除10月外, 变形菌在养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区。9月, 低密度组养殖区的放线菌相对丰度总是高于粪便收集区, 但是高密度组中情况则相反;当DOC最高时, 放线菌在养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区; 当DOC最低时, 放线菌在养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区。10和11月, 放线菌在低密度组养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区, 在高密度组养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区。7月, 放线菌在低密度组养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区, 而在8月的高密度组中情况则相反。8月, 拟杆菌在养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区, 在其他月份中养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区。10月, 蓝细菌在养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区。在11月低密度组中, 蓝细菌在养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区, 而在高密度组中养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区。其他月中, 除7月低密度组和8月高密度组外,蓝细菌在养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区。

图3 Sobs指数在低、高密度组中的变化Fig. 3 Sobs index variation in low and high stocking density channel

图4 Sobs指数在低高密度组中随DOC的变化Fig. 4 Sobs index variation with DOC in low and high stocking density channel

2.4 基于属水平的菌群变化

从整体上来看, 细菌丰度前十的物种为: 假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)、聚球菌(Synechococcus)、蓝细菌(Cyanobacteria)、CL500-29_marine_group、hgcl_clade、Alpinimonas、分枝杆菌(Mycobacterium)、MNG7和Limnohabitans(图 6)。从区域角度分析, 除8月外, 假单胞菌在养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区。除7月外,CL500-29_marine_group具有与之相同的变化趋势。聚球菌在养殖区的相对丰度总是高于粪便收集区,hgcl_clade和Alpinimonas在养殖区的相对丰度总是低于粪便收集区, 但差距不大。

7、8月, 假单胞菌在低、高密度组中的相对丰度差异巨大, 分别为(5.58%、0) 和 (0.76%、5.68%)。CL500-29_marine_group在低密度组中的相对丰度总是低于高密度组,Alpinimonas在除10月外的其他月中变化情况与此相同, 而hgcl_clade在低密度组中的相对丰度总是高于高密度组。7月和10月, 蓝细菌在低密度组中的相对丰度总是低于高密度组,其余月份则高于高密度组。

从DOC水平分析, 除8月外, 假单胞菌在DOC最高时的相对丰度远高于DOC最低时。除10月外, 黄杆菌也具有类似变化。除8月外,hgcl_clade在DOC最高时的相对丰度低于DOC最低时; 除7月外,Alpinimonas变化情况与之类似。7月和8月, 聚球菌在DOC最高时的相对丰度高于DOC最低时, 其他月份则相反。除9月外, 蓝细菌在DOC最高时的相对丰度远高于DOC最低时。

从季节性变化分析, 相对于其他月(低于2.46%), 聚球菌在7月(10.67%)和8月(15.22%)具有明显优势。黄杆菌的相对丰度在10月占据主导地位(21.64%), 但在8、9月的相对丰度则低于0.5%。假单胞菌在9—11月呈递增趋势;CL500-29_marine_group在7、8月占据优势, 但在9月相对丰度仅为2.14%, 且9—11月呈递减趋势。蓝细菌相对丰度在7—9月递增并在10月占比最低(1.67%)。hgcl_clade在8—10月、分枝杆菌在7—11月皆呈递减趋势。MNG7的相对丰度在季节变化中呈现“W”型。Alpinimonas在9—11月的占比远高于7、8月, 并在10月达到最高值。

图5 基于门水平的细菌群落柱状图分析Fig. 5 Community barplot analysis on phylum level

除了相对丰度前10的物种外,Polynucleobac-ter、Sediminibacterium、Paenibacilus、Pseudarcicella和12 up相对丰度在9、10月(DOC最低时)最高, 而分枝杆菌则是在7、11月(DOC最高时)丰度最高。

2.5 差异显著性分析

在95%的置信区间内进行单因素方差分析, 结果表明: 几乎每种细菌相对丰度均在不同月份间差异极显著(P＜0.01), 这表明菌群多样性具有显著的季节变化。DOC具有显著的区域差异和季节差异。当1天内DOC最低和最高时,hgcl_clade具有极显著的昼夜差异, 丛毛单胞菌、微小杆菌、罗多鲁纳念珠菌、Limnohabitans具有显著昼夜差异。

2.6 基于属水平的细菌群落相关性分析

相关性分析结果表明(表 2), 假单胞菌和DOC(r=0.415,P＜0.01)、水温 (r=-0.427,P＜0.01)皆具有极显著相关性, 但相关方向不同。聚球菌(r=0.636,P＜0.01)、蓝细菌(r=-0.448,P＜0.01)、Alpinimonas(r=-0.428,P＜0.01)和CL500-29_marine_group (r=0.755,P＜0.01) 皆与水温具有极显著相关性。分枝杆菌(r=0.488,P＜0.01)、MNG7(r=0.374,P＜0.01)与DOC具有极显著相关性。代表菌群丰富度的ace指数与DOC具有显著相关性(r=-0.330,P＜0.05)。此外,上述细菌种群相互间具有显著或极显著的相关性。

图6 基于属水平的细菌群落柱状图Fig. 6 Community bar plot analysis on genus level

3 讨论

微生物活性及多样性是池塘生态系统功能组成和不可分割的一部分[7,8], 也是全球生化循环过程的重要推动力[9]。在养殖生产中, 可能是由于溶解有机碳释放的昼夜节律, 部分菌群会在1天中的特定时间变得格外活跃[10]。DOC和菌群具有相互作用, 当DOC足够低时, 底泥微生物通过矿化和硝化作用向水体释放氨氮并造成水体二次污染[11]。同时, DOC也在不同程度上影响菌群的分解效率,当DOC维持在4 mg/L时菌群分解效率最高[12]。通过对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖高位池中细菌16S rRNA基因V4—V5区的高通量测序和生物信息学分析, 结果表明养殖前期高密度池浮霉菌丰度显著高于低密度池, 其他菌群差异不显著, 在养殖后期(50—80d)放养密度对菌群多样性的影响逐渐降低[13]。在本实验中, 在池塘工程化循环水养殖条件下, 所有养殖水槽共用同一水体, 或许受循环水流的影响, 不同放养密度的水槽中菌群差异不显著。

已有研究表明, DOC对细菌群落结构影响显著。基于Illumina-MiSeq测序结果表明, 在高DOC条件下菌群丰富度会降低[14], 这与本实验中ace指数与DOC具有显著负相关性(r=-0.330,P＜0.05)的结果相一致。另有研究认为, 较低水平的DOC可以增加菌群丰富度, 较高水平的DOC可以增加硝化细菌的丰富度[15]。当DOC维持在2 mg/L时, 菌群丰富度更高[12], 这或许可以对本实验中9月微生物多样性最高的结果作出解释(DOC均值2.56 mg/L)。对DOC差异显著性分析, 结果表明DOC具有显著的区域差异, 且养殖区高于粪便收集区。在9月之外的其他月份, 受DOC影响, 粪便收集区的菌群丰富度普遍高于养殖区, 且差异明显。

表2 基于属水平的菌群与DOC、水温的相关性分析Tab. 2 Correlations analysis about microbial communities with DOC, water temperature on genus level

在对左海湖的研究中, 刘兰英等[16]认为菌群结构的季节变化与水温和营养状况密切相关, 且不同季节中影响因素不同, 秋季主要受总氮、总磷、叶绿素的影响, 冬季主要受水温、pH、透明度的影响。此外, 亚硝酸氮[17]、化学需氧量[18]、NH3-N[19]降解速率等因素都可能对菌群产生影响。通过对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)养殖塘水体菌群年变化的研究分析, 杨宝丽[20]认为不同月份影响菌群多样性的因素不同: 6、7、8月菌群多样性与水温和无机氮盐正相关, 9月菌群多样性与pH负相关, 但在10和11月则与pH具有正相关性; 环境因子与水体菌群多样性的相关性大小为DOC＞无机氮盐＞水温＞盐度＞pH。在本实验中, 除9月粪便收集区外, DOC最低时的菌群丰富度普遍高于DOC最高时, 且菌群丰富度在低密度组中的变化幅度明显高于高密度组。这说明高密度组在季节变化中更有利于菌群结构保持稳定。DOC和水温在9和10月间差异极微, 但浮游动物却在10月骤然增多; Pernthaler等[21]研究发现微生物群落结构受到掠食性群落的影响,这或许可以对本实验中微生物多样性在10月最低的结果做出合理解释。

Villanueva等[22]研究认为, 相对于时间变换, 水体深度对菌群多样性影响更大。宋洪宁等[23]通过16S RNA基因末端限制性片段分析技术并结合典型对应分析研究了环境因子对东平湖菌群结构的影响, 结果表明64.5、164、509、543和558 bp T-RFs的丰度与水深呈正相关。在IPRS中, 水槽前端提气推水致不同层次的水体混合, 水深是否对菌群结构有影响还有待进一步研究。Natalie Hicks等[8]研究认为, 相对于二氧化碳或温度的昼夜变化, 环境内的平均温度对菌群群落组成具有显著影响(P=0.002)。细胞外酶活性、细菌碳排放、群落呼吸等皆具有显著的时间变化, 主要与季节温度和基质利用率变化有关[24]。在本实验中, 基于属水平分析, 相对丰度前7的物种中, 5种皆与水温的相关性极显著(P＜0.01), 水温的季节变化或许可以对微生物多样性的季节变化做出合理解释。

在本实验中, 变形菌、放线菌、拟杆菌和蓝细菌在7—11月的季节变化中始终作为优势物种, 在对鲤鱼(Cyprinus carpio)养殖塘[25]、青蟹(Scylla paramamosain)[26]、凡纳对虾[12]和团头鲂(Megalobrama amblycephala)[27]的研究中也得到了类似结论。基于属水平分析, 假单胞菌、黄杆菌和聚球菌为优势菌; 蓝细菌、CL500-29_marine_group、hgcl_clade、Alpinimonas、分枝杆菌、MNG7和Limnohabitans为次优势菌。其中, 假单胞菌对好氧污泥颗粒的形成和稳定运行具有重要意义[28], 还可以防止真菌病害[29], 降低重金属危害[30], 降解苯酚[31]、硝基苯[32]、甲基对硫磷[33]等有机污染, 在水质净化和生态调控中发挥积极作用。聚球菌在海洋中丰度极高, 对总初级生产力的贡献可达20%以上[34]。Limnohabitans相对于其他浮游细菌细胞体积更大,因此在浮游细菌总生物量中占有较大比例[35];Limnohabitans还可以作为食物来源调控异养鞭毛虫的生长和群落组成[36]。在本实验中, 假单胞菌和聚球菌在不同月份中占据主要优势, 可见水体微生态处于较好水平。但是, 分枝杆菌属含有较多致病菌,黄杆菌为条件致病菌; 当水体富营养化时, 蓝细菌还会爆发造成“水华”现象; 某些种类在代谢过程中产生多种毒素, 威胁水生动物健康。因此, 在养殖管理过程中需要对潜在风险进行防范。