基于微卫星标记的圆口铜鱼亲子鉴定技术

何勇凤 朱永久 吴兴兵 龚进玲 杨德国

(中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉 430223)

圆口铜鱼[Coreius guichenoti(SauvageetDabry)],隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、亚科(Gobioninae)、铜鱼属(Coreius), 主要分布于长江上游干流及雅砻江、乌江等大型支流中, 是典型的河道洄游性鱼类和产漂流性卵鱼类[1—3]。圆口铜鱼为长江上游特有鱼类, 也是重要的经济鱼类。圆口铜鱼的产卵场仅发现于金沙江中下游以及雅砻江干流下游[4—6], 随着长江上游水电开发的逐步实施, 不仅其完成生活史的通道因筑坝截流而被阻, 而且其产卵场环境有可能遭受毁灭性破坏。同时, 由于长期的过度捕捞、无节制的资源掠夺,圆口铜鱼种群资源呈现明显的下降趋势, 如20世纪60—70年代在金沙江下游占渔获量的50%以上[1],在金沙江下游宜宾江段由20世纪90年代占渔获量的11.53%下降至2005年的7.93%[7], 在金沙江下游绥江段由2011年占渔获量的12.98%下降至2015年的4.16%[8], 而由于金沙江一期工程的修建蓄水, 金沙江下游水富/宜宾断面圆口铜鱼的早期资源补充量由2008年的2.12亿粒(尾)下降至2012年的0.82亿粒(尾), 2013年更是呈现无圆口铜鱼早期资源补充的状况[9]。由此可见, 其物种生存与延续面临巨大的威胁。开展圆口铜鱼增殖放流是保护圆口铜鱼资源的重要手段。目前, 已有多个水电工程将圆口铜鱼列为增殖放流对象, 多家科研单位对圆口铜鱼人工驯养与繁殖技术开展攻关研究, 并取得了突破性进展。随着圆口铜鱼增殖放流逐步开展和人工养殖逐渐增多, 如何快速有效地鉴别不同的圆口铜鱼家系及来源, 是高效评估圆口铜鱼增殖放流效果、加强养殖及自然种群遗传管理以防止近亲交配导致其种群遗传多样性下降的关键技术支撑。

亲子鉴定(Parentage identification), 又称亲权鉴定, 是利用生物学、分子遗传学及医学的理论和技术, 从子代和亲代的形态构造、生理机能、遗传物质基础等方面来分析遗传特征, 判断亲代与子代之间是否具有亲缘关系的方法, 其遗传学基础是孟德尔基因分离定律和基因自由组合定律。亲子鉴定不仅在法医学上有重要作用, 而且在水生生物、畜牧业生产中具有重要实际应用价值, 如建立系谱档案以避免或减少近亲繁殖造成的种群衰退、增殖放流效果评估等[10—12]。目前用于亲子鉴定的DNA标记主要有微卫星标记(Simple sequence repeats,SSR)、SNP标记和线粒体标记等, 其中SSR标记由于具有多态性丰富、杂合度高、稳定性好、共显性遗传、遵循孟德尔遗传定律、检测快速方便等优点, 在鱼类亲子鉴定中得到了广泛应用, 如中华鲟(Acipenser sinensisGray)、川陕哲罗鲑(Hucho bleekeriKimura)、大西洋鳕(Gadus morhuaLinnaeus)、胭脂鱼[Myxocyprinus asiaticus(Bleeker)]、青鱼[Mylopharyngodon piceus(Richardson)]、草鱼[Ctenopharyngodon idellus(CuvieretValenciennes)]、翘嘴鳜[Siniperca chuatsi(Basilewsky)]等[10—16]。然而, 目前并无将微卫星标记应用于圆口铜鱼亲子鉴定的报道。

本研究以圆口铜鱼人工繁殖家系群体为实验材料, 结合文献中已报道的微卫星标记, 建立圆口铜鱼微卫星亲子鉴定技术, 以期为圆口铜鱼的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2017年6—7月期间, 在中国水产科学研究院长江水产研究所武汉研究中心养鱼车间挑选健康成熟的圆口铜鱼亲本进行人工繁殖。按雌雄数量1:1比例得到5个全同胞家系(JX1—JX5), 每个家系随机选取32—40尾子代, 分别为Z1-01—Z1-40、Z2-01—Z2-40、Z3-01—Z3-32、Z4-01—Z4-40、Z5-01—Z5-34; 按雌雄数量X:X比例(非1:1比例)得到3个混合家系(JX6—JX8), 每个家系随机选取34—41尾子代, 分别为Z6-01—Z6-36、Z7-01—Z7-34、Z8-01—Z8-41; 其中家系JX1的父本、母本分别为F1、M1; 家系JX2的父本、母本分别为F2、M2; 家系JX3的父本、母本分别为F3、M3; 家系JX4的父本、母本分别为F4、M4; 家系JX5的父本、母本分别为F5、M5; 家系JX6的父本为F61、F62, 母本为M6; 家系JX7的父本为F4、F5和F7, 母本为M4、M5; 家系JX8的父本为F81、F82、F83、F84、F85, 母本为M81、M82、M83。候选亲本样本由22尾真正亲本(父本: F1、F2、F3、F4、F5、F61、F62、F7、F81、F82、F83、F84、F85; 母本:M1、M2、M3、M4、M5、M6、M81、M82、M83)和20尾非亲本(雌雄各10尾)样本组成。同时, 采集了长江上游泸州江段23尾野生个体作为引物筛选的样本。采用无水乙醇保存候选亲本的鳍条样本及子代刚孵化出膜的全鱼样本, 4℃保存备用。

1.2 实验方法

基因组DNA提取采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)试剂盒提取圆口铜鱼样本基因组DNA, 采用2%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和完整性, 于-20℃保存。

引物筛选从文献中发表的圆口铜鱼微卫星标记中筛选出40对微卫星引物[17—20], 由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。以65尾圆口铜鱼个体(包括22尾候选亲本、20尾非亲本和23尾野生个体)DNA为模板来进行PCR扩增, PCR反应体系15 µL, 包括2×TaqPCR Master Mix 7.5 µL、基因组DNA模板(浓度50 ng/µL)0.5 µL、上游引物(浓度10 pmol/µL) 1 µL、下游引物(浓度10 pmol/µL) 1 µL、ddH2O 5 µL。PCR扩增程序为: 95℃预变性5min;95℃变性30s, 62℃→52℃ touch down退火30s, 72℃延伸30s, 进行10个循环; 95℃变性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸30s, 进行22个循环; 最后72℃再延伸20min。采用12%聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳分离, 检测引物的扩增效果和扩增效率。

荧光标记及基因分型依据每对微卫星引物扩增片段的大小, 对筛选出的微卫星引物进行两两组合, 组合内的引物分别在F引物的5′端加上荧光标记(FAM、HEX、ROX或TMR), 由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。利用此荧光引物对圆口铜鱼DNA样品进行降落PCR扩增, PCR反应体系10 µL, 包括2×TaqPCR Master Mix 5 µL、基因组DNA模板(浓度50 ng/µL)1 µL、上游引物(浓度10 pmol/µL) 0.1 µL、下游引物(浓度10 pmol/µL) 0.4 µL、带FAM荧光的M13引物(序列: TGTAAAACGACG GCCAGT, 浓度10 pmol/µL) 0.4 µL、ddH2O 3.1 µL。降落PCR扩增程序同引物筛选部分。在PCR结束后, 取2 µL PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳检测其浓度, 根据浓度鉴定值对产物进行稀释, 组成二重组合, 各取1 µL 稀释PCR产物加入到7 µL含有荧光内标LIZ500的甲酰胺中, 使用测序仪ABI 3730XL对产物进行毛细管荧光电泳检测和基因分型。

亲子鉴定分析根据测序仪分型结果, 利用软件GeneMarker v.2.2.0[21]读取个体等位基因大小,并加以人工校正, 获得基因型数据矩阵。采用软件Cervus v.3.0[22]对基因型数据进行等位基因频率分析、模拟分析和亲子分析, 统计参数主要包括等位基因数(Number of allele,Na)、期望杂合度(Expected heterozygosity,He)、观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)、多态信息含量(Polymorphism information content,PIC)、无效等位基因频率(Null allele frequency,F(Null))、哈迪温伯格平衡检测(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、平均排除概率(Exclusion probability,EP)、累积排除概率(Combined exclusion probability,CEP)、似然率对数值(The nature log of the overall likelihood ratio,LOD)以及置信度(Confidence)。

2 结果

2.1 微卫星标记的筛选

本研究从已报道的40对圆口铜鱼微卫星引物中筛选出20对多态性较高、扩增效果较好的微卫星引物(表 1), 用于建立二重毛细管电泳和亲子鉴定。将20对微卫星引物进行不同的荧光标记后, 单独进行PCR扩增, PCR扩增产物两两组合, 使用测序仪ABI 3730XL对组合后的产物进行毛细管荧光电泳检测和基因分型, 从而建立10组圆口铜鱼微卫星标记的二重毛细管电泳技术。

利用筛选出的10组20个微卫星标记对圆口铜鱼65尾个体扩增结果显示, 单个位点等位基因数(Na)为5—31个, 平均等位基因数为10.45个; 多态信息含量(PIC)为0.337—0.949, 平均值为0.652; 期望杂合度(He)为0.366—0.958, 平均值为0.696, 观测杂合度(Ho)为0.415—0.923, 平均值为0.697。所有位点均符合哈迪温伯格平衡(P＞0.05)。

2.2 遗传多样性

利用10组20个微卫星标记对圆口铜鱼42尾候选亲本和297尾子一代进行扩增, 结果显示, 20个位点检测的等位基因数为180个, 单个位点等位基因数(Na)为5—27个, 平均等位基因数为9个; 多态信息含量(PIC)为0.219—0.884, 平均值为0.616; 期望杂合度(He)为0.226—0.895, 平均值为0.659, 观测杂合度(Ho)为0.222—0.950, 平均值为0.691。所有位点的无效等位基因频率F(Null)均低于0.1。HWE检验显示, 8个位点符合哈迪温伯格平衡(P＞0.05), 12个位点显著偏离哈迪温伯格平衡(P＜0.05)。20个位点在圆口铜鱼339个家系样本中具体遗传参数见表 2。

利用10组微卫星标记对圆口铜鱼8个家系子一代群体和候选亲本群体单独进行遗传多样性分析,结果显示, 子一代群体的平均等位基因数为3.02, 平均多态信息含量为0.459, 平均期望杂合度为0.529,平均观测杂合度为0.689; 候选亲本群体的平均等位基因数为8.95, 平均多态信息含量为0.647, 平均期望杂合度为0.694, 平均观测杂合度为0.702 (表 3)。由此可见, 圆口铜鱼子一代群体的遗传多样性明显低于候选亲本群体。

2.3 排除概率

排除概率分析结果显示, 当双亲基因型未知时,单个微卫星位点的单亲排除概率(E-1P)为0.027—0.643, 平均值为0.296, 单亲累积排除概率(CE-1P)为0.99954473; 当单亲基因型已知时, 单个微卫星位点的排除概率(E-2P)为0.123—0.784, 平均值为0.449, 累积排除概率(CE-2P)为0.99999825; 当双亲基因型未知时, 单个微卫星位点的双亲排除概率(E-PP)为0.225—0.926, 平均值为0.613, 双亲累积排除概率(CE-PP)为1.00000000 (表 4)。

2.4 亲子分析

模拟和亲子分析中, 参数设置为: 模拟10000次亲子鉴定, 置信度为95%, 候选父母本数均为200,父母本的抽样比例为0.85。Parent pair分析结果显示, 随着微卫星位点的增加, 圆口铜鱼亲子鉴定准确率在不断的提高(图 1), 尤其当使用20个微卫星位点时, 297尾子一代均能正确找到其父母本, 亲子鉴定准确率为100%; 所有子一代个体的TrioLOD值均大于0, 其中全同胞和半同胞家系(JX1-JX6)所有222尾子一代的置信度均达到95%, 而混合家系(JX7-JX8)75尾子一代中除9尾子一代的置信度仅达到80%外, 其余子一代个体置信度也达到了95%; 所有子一代个体中有224尾个体(占总个体数的75.4%)未出现错配位点, 有49尾个体(占总个体数的16.5%, 其中全同胞家系子一代仅11尾个体)出现1个错配位点, 有18尾个体(占总个体数的6.1%, 全部为混合家系子一代)出现2个错配位点, 有6尾个体(占总个体数的2.0%, 全部为混合家系子一代)出现3个错配位点。

3 讨论

3.1 基于微卫星标记的圆口铜鱼亲子鉴定技术

多态信息含量(PIC)是衡量位点多态性的重要指标, 一般认为当PIC0.25为低度多态, 0.25＜PIC＜0.5为中度多态,PIC＞0.5为高度多态[23]。本研究20个微卫星位点在圆口铜鱼野生群体中有16个位点呈现高度多态性, 4个位点呈现中度多态性, 说明这20个微卫星位点能提供丰富的遗传信息。本研究的20个微卫星位点在圆口铜鱼人工繁殖的亲本群体和子代群体中有12个位点显著偏离哈迪温伯格平衡, 其中10个位点表现为杂合子过剩现象, 可能是因为有限的亲本繁殖子代导致连锁不平衡现象引起的, 另2个位点表现为杂合子缺失, 可能是因为小种群中非随机交配等原因造成的。但这20个微卫星位点在圆口铜鱼野生群体中均不偏离哈迪温伯格平衡, 而且在双亲信息未知、单亲信息已知、双亲信息已知的情况下, 其20个微卫星位点的累积排除概率均大于99.99%。因此, 本研究筛选出的20个微卫星位点, 可作为有效的遗传标记进一步用于圆口铜鱼的亲子鉴定分析。

表1 圆口铜鱼微卫星引物序列、荧光物质和多重毛细管电泳组合信息Tab. 1 Sequence, fluorescence label and group information of multiple capillary electrophoresis of microsatellite primers in Coreius guichenoti

在水生生物的亲子鉴定研究中, 最常用的鉴定方法是基于似然比的似然法, 其中似然率对数值LOD、置信度和错配位点数是关键指标。LOD值等于0表示候选父亲与群体中随机雄性个体成为子代真实父亲的可能性相同,LOD值小于0表示候选父亲不可能为子代的真实父亲,LOD值大于0则认为候选父亲最有可能是子代的真实父亲,LOD值越大, 可靠性越高[22]。在本研究中通过20个微卫星位点检测了圆口铜鱼8个家系子一代个体与候选亲本间的亲子关系, 圆口铜鱼亲子鉴定的准确率达到了100%, 而且所有子一代个体的LOD值均大于0, 置信度达到95%的子一代个体数量占97.0%, 未出现错配位点和仅出现1个错配位点的子一代个体数量占91.9%。这说明基于本研究筛选出的20个微卫星标记建立的圆口铜鱼亲子鉴定技术是可靠的, 可进一步用于圆口铜鱼的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估等方面的研究。

表2 采用20个微卫星位点检测获得圆口铜鱼遗传多样性参数Tab. 2 Genetic diversity parameter of Coreius guichenoti by using 20 microsatellite markers

表3 圆口铜鱼子一代群体和候选亲本群体遗传多样性参数Tab. 3 Genetic diversities of parents and offspring in Coreius guichenoti

3.2 圆口铜鱼亲本贡献率分析

本研究中涉及圆口铜鱼5个全同胞家系和3个混合家系, 在全同胞家系中亲本对子代的贡献率是已知的, 而在混合家系中亲本对子代的贡献率大小却是未知的。因此, 本研究通过亲缘关系分析了在混合家系中圆口铜鱼不同亲本对子代的贡献率大小, 这有助于指导圆口铜鱼的人工繁育生产过程。在本研究3个混合家系中半同胞家系JX6的父本F61和F62对子代的贡献率分别为94.44%和5.56%,母本M6对子代的贡献率为100%; 混合家系JX7的父本F4、F5、F7对子代的贡献率分别为0、11.76%、88.24%, 母本M4、M5对子代的贡献率分别为0、100%; 混合家系JX8的父本F81、F82、F83、F84、F85对子代的贡献率分别为0、73.17%、24.39%、0、2.44%, 母本M81、M82、M83对子代的贡献率分别为2.44%、95.12%、2.44%。由此可见, 在圆口铜鱼人工繁殖过程中, 尽管采用了多对多配对方式, 但不同亲本对子代的贡献率存在显著差异, 可能是由于某些亲本的配子受精率、成活率低等原因造成的。实际上, 这种贡献的不均衡可能会导致一些等位基因的丢失, 通过累代的繁殖, 可能会造成子代群体遗传多样性水平的降低。因此,在圆口铜鱼人工繁殖生产过程中, 作者建议及时发现贡献率低下的亲本, 适时剔除, 补充新亲本个体,从而达到改良产卵群体和减少保种压力的目的。

表4 圆口铜鱼20个微卫星位点排除概率和累积排除概率Tab. 4 Exclusion probability and combined exclusion probability of twenty microsatellites in Coreius guichenoti

图1 不同微卫星位点数目下的圆口铜鱼亲子鉴定准确率Fig. 1 The assignment success rate of progeny to correct parent pair based on parent and offspring genotypes of Coreius guichenoti

综上所述, 在对文献记载的40对微卫星引物筛选的基础上, 本研究利用筛选出的20对微卫星引物对8个圆口铜鱼家系样本进行微卫星DNA基因分型研究, 亲子鉴定准确率达到100%, 所有子一代个体的LOD值均大于0, 置信度达到95%的子一代个体数量占97.0%, 未出现错配位点和仅出现1个错配位点的子一代个体数量占91.9%, 建立了以20个微卫星标记为基础的圆口铜鱼荧光微卫星标记与多重毛细管电泳相结合的亲子鉴定技术, 可为圆口铜鱼的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供科学依据。