病变红细胞的原子力显微镜显微观察测试

郭志峰

(神华准能资源综合开发有限公司 研发中心，内蒙古 鄂尔多斯 010300)

人体血液中主要的细胞为红细胞，因此红细胞的形态对血液维持人体正常的生理机能有着非常重要的影响[1]。血液中红细胞的形态特征及其体积、容积等细胞病理变化是对某些疾病诊断和研究的重要依据[2,3]。正常红细胞的形态为中央凹陷的圆盘状，边缘较厚，直径约5～8μm，细胞膜表面呈光滑状。在病理状况下，红细胞的显微形态在致病因素影响下会发生变化，如棘状红细胞增多症所导致的红细胞形状变异为表面长满突起的棘状。红细胞对其微环境的变化非常敏感，当细胞内离子浓度，ATP和膜骨架蛋白的结构发生变化时，细胞的形态就会发生改变，当人体受到某些疾病侵害时可导致红细胞膜脂质双层的蛋白结构不稳定，从而使其发生病理改变，因而可以通过观察红细胞的显微形态为某些疾病的诊断提供重要依据[4,5]。目前，可以用于生物细胞显微形态的观察仪器主要有光学显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜等。光学显微镜操作简便易行，应用范围广，但光学显微镜由于可见光波长的限制，分辨率低，不能清晰地观察到红细胞的显微形态及细胞膜的表面细微状态，因而其应用受到了很大的限制。扫描电子显微镜是应用非常广泛的显微形貌观察仪器，但由于扫描电镜主要适合于观察导电性良好的样品，对于人体红细胞这种导电性非常差的样品来说，即使对其进行喷金镀膜处理后，其观察效果也非常不好，同时由于扫描电镜不能测量红细胞表面的粗糙度数据，因而其不能对红细胞膜表面的平整度进行评价。原子力显微镜(AFM)是通过探针与被测样品之间的微弱相互作用力即原子力来获得物质表面形貌的信息。AFM能够在真空、空气或溶液环境中直接对生物大分子等生物材料进行测试，获得直观的三维形貌和尺寸信息，并具有纳米级别的分辨率；能够在近生理的环境中对生物样品进行纳米级测试和操纵，对其活性过程进行跟踪观察[6-8]，因此在生物结构的研究中具有独特的优势，目前已被广泛应用于多肽、DNA、核酸、蛋白质、微生物、细胞、透明质酸等各种生物材料显微结构的观察研究[9-15]，然而其专门用于人体血液中红细胞显微形态的测试研究方面的报道还非常少。本文专门采用AFM分别对人体正常和各种病变的红细胞显微形态进行了对比测试研究，以期为因红细胞变异所导致的人体某些疾病的快速诊断提供可靠的依据。

1 样品制备方法与仪器测试条件

1.1 样品制备方法

实验所需血样均由内蒙古医科大学第一附属医院血液科提供,分别取自新鲜抗凝正常人体血液和棘形红细胞、口形红细胞、靶形红细胞增多症等病变血液各1.0mL，按1:1比例直接滴入等量的固定液(4%多聚甲醛-2.5%戊二醛),4℃固定1h，然后低速离心5min,弃去上清液，用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗并重新离心去上清液3次，而后依次用50%、70%、90%的无水乙醇梯度脱水，吹散后，用滴管取含有红细胞的乙醇溶液滴在预先处理好的盖玻片上(盖玻片上覆盖一层Formvar膜)，氮气吹干后待测。

1.2 仪器与测试条件

原子力显微镜测试采用德国布鲁克公司生产的Dimension Edge型原子力显微镜，测试采用轻敲模式，在空气环境中进行测试，探针采用针尖曲率半径为8nm，力常数为40N/m，共振频率为331.179kHz的硅探针，扫描范围分别为20×20μm、10×10μm、1×1μm，扫描频率为0.5Hz。

2 实验结果

2.1 原子力显微镜对正常红细胞的测试结果

图1、图2分别为单个和多个人体正常红细胞的AFM显微三维图像，从图中可以看到人体血液中正常的红细胞形态均匀，呈中央双凹的圆盘形，中央较薄，边缘较厚，细胞膜表面光滑。图1右侧部分为通过NanoScope分析软件在左侧单个红细胞上面沿着红线处所拉取的截面线，从截面线数据可以得出单个人体正常红细胞的直径在7.8μm左右，中央凹陷部分深度在1.3μm左右。通过NanoScope分析软件对图2中所测到的6个正常红细胞尺寸进行统计后得出其平均直径为7.5μm，中央凹陷部分平均深度为1.5μm。通过让探针精确定位到红细胞膜表面进行小范围精细扫描可以得到红细胞膜表面的显微结构三维图(图3)，通过NanoScope分析软件可以得到所测区域的平均粗糙度值为3.03nm，均方根粗糙度值为3.68nm。从图3和粗糙度数据可以看到人体正常红细胞表面均由形态均匀的纳米小颗粒组成，表面极其光滑，这与Zhang等[16]的测试结果所一致，这也可以证实此测试方法的可靠性。

图2 多个正常红细胞的AFM三维形貌图

Fig.2 The 3D image of multiple normal erythrocytes

图3 正常红细胞细胞膜表面局部放大三维形貌图

Fig.3 The 3D image of erythrocyte membrane surface

2.2 原子力显微镜对棘形红细胞的测试结果

图4左侧部分为人体病变血液中棘形红细胞变形初期的AFM显微三维图像，图4右侧部分为通过NanoScope分析软件在左侧单个红细胞上面沿着红线处所拉取的截面线，从图中可以看到棘形红细胞在变形初期其直径大小并未发生明显的变化，而其中央凹陷部分则在逐渐上翻，在细胞膜表面开始逐渐长出小的凸起，随着中央凹陷部分的逐渐上翻和凸起的逐渐长大(如图5a所示)，最后完全变为棘形红细胞(如图5b所示)。图6为多个棘形红细胞的AFM三维形貌图，从图中也可以看到从正常红细胞到棘形红细胞是一个逐步变形的过程。通过让探针精确定位到变形初期的棘形红细胞膜表面进行小范围精细扫描可以得到变形初期的棘形红细胞膜表面的显微结构三维图(图7)，通过NanoScope分析软件可以得到所测区域的平均粗糙度值为3.61nm，均方根粗糙度值为4.40nm。从图7可以看到变形初期的棘形红细胞膜表面形貌与正常红细胞膜表面形貌有很大的不同，细胞膜表面的纳米小颗粒开始膨胀变大，这也就可以从微观角度解释棘形红细胞棘形凸起生成的原因，粗糙度数据也表明棘形红细胞表面粗糙度比正常红细胞表面粗糙度要大，从这一点也可以说明棘形红细胞在变形初期其细胞膜表面的微观结构已经发生了变化。通过NanoScope分析软件得到变形中期和完全变形后的棘形红细胞膜表面的平均粗糙度值分别为10.31nm和70.64nm，这说明随着红细胞的变形，其膜表面逐渐变得粗糙。红细胞微观结构的改变表明红细胞的生理性质发生了改变，红细胞的弹性和变形能力以及运载氧的能力也肯定会受到影响。

(a)

(b)

图5 单个棘形红细胞变形中期(a)和完全变形后(b)的AFM三维形貌图

Fig.5 The 3D image of single acanthocyte in the middle (a) and last (b) stage of deformation

图6 多个棘形红细胞的AFM三维形貌图

Fig.6 The 3D image of multiple acanthocytes

图7 棘形红细胞细胞膜表面局部放大三维形貌图

Fig.7 The 3D image of acanthocyte membrane surface

2.3 原子力显微镜对口形红细胞的测试结果

图8、图9分别为单个和多个人体病变血液中口形红细胞的AFM显微三维图像，从图中可以看到口形红细胞变形严重，分裂为多层圆环状结构。图8右侧部分为通过NanoScope分析软件在左侧单个红细胞上面沿着红线处所拉取的截面线，可以得出变异后红细胞的直径在9.0μm左右，中央凹陷部分深度在1.4μm左右。通过NanoScope分析软件对图9中所测到的4个口形红细胞尺寸进行统计后得出其平均直径为9.2μm，中央凹陷部分平均深度为1.3μm。从以上数据可以看到变异后的红细胞其直径稍微变大，中央凹陷部分逐渐缩小为扁口形。通过让探针精确定位到口形红细胞膜表面进行小范围精细扫描可以得到口形红细胞膜表面的显微结构三维图(图10)，通过NanoScope分析软件可以得到所测区域的平均粗糙度值为42.3nm，均方根粗糙度值为52.2nm。从图10可以看到口形红细胞膜表面微观形貌与正常红细胞膜表面微观形貌完全不同，膜表面也开始分裂为小的环形结构，这说明口形红细胞分裂为多层圆环状结构是一个逐步分裂的过程，由于细胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急剧上升。

图9 多个口形红细胞的AFM三维形貌图

Fig.9 The 3D image of multiple stomatocytes

图10 口形红细胞细胞膜表面局部放大三维形貌图

Fig.10 The 3D image of stomatocyte membrane surface

2.4 原子力显微镜对靶形红细胞的测试结果

图11、图12分别为单个和多个人体病变血液中靶形红细胞的AFM显微三维图像，从图中可以看到靶形红细胞仍呈圆盘状，但其变形严重，分裂为多层圆环状结构，凹陷中央有圆拱形凸起，通过NanoScope分析软件在图11左侧单个红细胞上面沿着红线处拉取截面线，可以得到变异后的靶形红细胞直径在9.7μm左右，中央凹陷部分深度在0.7μm左右。通过NanoScope分析软件对图12中所测到的4个正常红细胞尺寸进行统计后得出其平均直径为10.2μm，中央凹陷部分平均深度为0.5μm。从以上数据可以看到变异后的红细胞其直径稍微变大，中央凹陷部分逐渐上翻形成圆拱形凸起。通过让探针精确定位到靶形红细胞膜表面进行小范围精细扫描可以得到靶形红细胞膜表面的显微结构三维图(图13)，通过NanoScope分析软件可以得到所测区域的平均粗糙度值为11.1nm，均方根粗糙度值为13.2nm。从图13可以看到靶形红细胞膜表面微观形貌与正常红细胞膜表面微观形貌完全不同，膜表面也开始分裂为小的环形结构，这说明靶形红细胞分裂为多层圆环状结构也是一个逐步分裂的过程，由于细胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急剧上升。

图12 多个靶形红细胞的AFM三维形貌图

Fig.12 The 3D image of multiple target erythrocytes

图13 靶形红细胞细胞膜表面局部放大三维形貌图

Fig.13 The 3D image of target erythrocyte membrane surface

3 结 论

通过原子力显微镜对人体血液中正常红细胞和病变红细胞的比较测试研究发现，原子力显微镜具有非常高的分辨率。既可以用于红细胞的整体三维形貌成像，可以清晰地观察到正常红细胞和病变红细胞不同的显微形态，并可以对正常红细胞和病变红细胞的整体三维尺寸进行精确测量，这可为人体血液中红细胞疾病的快速诊断提供可靠的依据；又可以对红细胞细胞膜表面的显微结构进行三维成像并测量细胞膜表面的粗糙度数据，从而为人体血液中红细胞疾病的病理研究提供依据。与红细胞形态改变相关的疾病包括神经系统疾病、血液系统疾病、感染性疾病等部分疑难诊断的病例，当常规检验方法难以确诊时，原子力显微镜检查可以提供重要的病理诊断依据。该测试手段完全可以用于红细胞形态相关的疾病的快速诊断与病理研究,还可以应用于医学其它类似领域。