三碘甲腺原氨酸对缺氧/复氧致乳小鼠心室肌细胞钙离子通道异常的影响及其信号通路机制

刘 磊 曾 彬 廖小婷

武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北武汉 430060

三碘甲腺原氨酸（T3）是甲状腺分泌的主要活性物质之一，T3已经证明可以改善心肌收缩功能，保护受损后心功能[1-2]。PI3K/Akt 信号通路参与心肌缺血再灌注损伤，且激活这一通道能减少缺血再灌注损伤，保护心肌[3]。T3可以激活Akt 信号通路从而发挥心脏保护作用，但T3对心肌细胞电生理的影响研究很少。本研究建立缺氧/复氧（H/R）模型，并用膜片钳全细胞技术观察T3对乳小鼠心室肌细胞L-型钙离子通道电流（ICaL）的作用，旨在探讨T3对心脏钙离子通道的影响，并且验证PI3K/Akt 信号通路是否在其中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 1～2 d 新生C57BL/6 小鼠20 只，雌雄不限，合格证号：SCXK（鄂）2015-0018，由湖北省实验动物中心提供。

1.1.2 药品和试剂 DMEM-F12 培养基（Hyclone 公司）；胎牛血清（Gibico 公司）；胶原酶Ⅱ、甲状腺素T3、LY294002（Sigma 公司）；胰酶（Beyontime 公司）；兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K（美国CST 公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（美国ASPEN 公司）；未注明者均为国产分析纯。

1.1.3 溶液配制 记录ICaL的细胞外液成分：氯化胆碱100 mmol/L，NaCl 35 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，BaCl20.1 mmol/L，4-氨基吡啶3 mmol/L，NaOH 调整pH 值到7.35。记录ICaL电极内液成分：CsCl2120 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L，MgCl25 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，CSOH 调整pH 值到7.2。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养 参照之前的方法[4]，取20 只1～2 d 小鼠，将心脏置于预冷PBS 液中清洗，留取心室并将心室肌组织剪碎，吸入含10 mL 的0.125%胰酶的离心管中4℃过夜。后用含0.035%胶原酶Ⅱ的消化液于37℃水浴振摇消化，待液体变混浊后停止消化，重复消化6～7 次直至消化完全。将收集的上清液1000 r/min 离心10 min，用含15%胎牛血清的完全培养液重悬细胞。接种于10 cm 培养皿中并置于培养箱（37℃、5%CO2）中差速贴壁1 h，将细胞悬液种于35 mm（1×106/mL）培养皿中培养。

1.2.2 心肌细胞H/R 模型的建立及实验分组 细胞贴壁完全且搏动良好后，将培养液换为2 mL PBS 液，于缺氧培养箱（94%N2，5%CO2，1%O2，37℃）中培养4 h。随后吸去PBS 液，更换为完全培养液并放入普通培养箱中培养24 h，即完成H/R 过程。本实验分为五组：正常对照（Control）组、H/R 组、T3+H/R 组、T3+H/R+LY 组、H/R+LY 组。T3（20 ng/mL）在H/R 前24 h 加入培养液中；LY294002（LY）为PI3K/Akt 通路阻滞剂[5]，在细胞H/R 前24 h 以10 μmol/L 加入培养液中。

1.2.3 ICaL的记录 应用全细胞膜片钳技术记录细胞钙离子通道电流，微电极充灌电极内液后电阻在5～7 MΩ。室温下，将细胞放入细胞槽内，用电极外液以2～3 mL/min 的流速进行灌流。选用大小相近、细胞状态良好的细胞进行实验。待高阻封接形成后，负压脉冲破膜，补偿膜电容、串联电阻及漏电流，形成全细胞记录方式，平衡5 min，待电极内液与细胞内液交换充分后，进行膜电流记录。膜电流的大小以电流密度，即pA/pF 表示。

1.2.4 Western blot 测定PI3K/Akt 通路的蛋白表达 在培养皿中加入裂解液进行蛋白提纯，采用BCA 法进行蛋白定量，SDS-PAGE 电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，然后用兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K 抗体4℃孵育过夜。次日用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h，化学发光法（ECL）显影。采用凝胶成像系统（美国UVP 公司）进行分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin 条带灰度值的比值反映P-Akt 和P-PI3K 的表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T3对乳鼠心肌细胞H/R 损伤ICaL的影响

形成全细胞构型后，在电压钳模式下记录电流。钳制电位固定于-40 mV，指令电压从-50 mV 以10 mV为步阶逐步阶跃至+60 mV。各组电流-电压（I-V）曲线形状近似。与Control 组比较，H/R 组ICaL峰值电流减小（P ＜0.01），I-V 曲线上移；与H/R 组比较，T3+H/R 组ICaL峰值电流增大（P ＜0.01），T3能部分恢复H/R损伤引起的I-V 曲线上移，且T3+H/R 组I-V 曲线左移，峰值电位从+10 mV 减小至-10 mV；与H/R 组比较，H/R+LY 组ICaL峰值电流减小（P ＜0.01）；与T3+H/R 组比较，T3+H/R+LY 组ICaL峰值电流减小（P ＜0.01）。见图1。

2.2 T3对H/R 乳鼠心室肌细胞ICaL稳态失活曲线及稳态激活曲线的影响

采用双脉冲实验方法测定失活曲线，钳制电压-40 mV，将保持电位维持在-50 mV，从-50 mV 增加到60 mV（跃阶10 mV），记录内向峰电流，然后给测试电位0 mV，持续300 ms。以电流的相对值（I/Imax）对条件脉冲电压作图，得出ICaL稳态失活曲线（图2a）。依Boltzman 方程I/Imax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]进行拟合。式中Imax为最大膜电流，V1/2为半数失活电压，K 为斜率参数。结果显示，与Control 组比较，H/R 组V1/2减小[（-16.10±4.03）mV 比（-25.32±1.48）mV，P <0.05]，失活曲线右移，失活减慢。与H/R 组比较，T3+H/R组[（-24.49±1.58）mV]的V1/2增大（P <0.05），失活曲线左移，失活加快。各组K 值差异无统计学意义（P >0.05）。

将ICaL的I-V 曲线的结果转化为膜电导（G），对条件刺激电压作图，采用Boltzman 方程G/Gmax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]进行拟合，得到ICaL稳态激活曲线（图2b）。Gmax为最大膜电导，V1/2为半数激活电压，K 为斜率参数。结果显示，与Control 组比较，H/R 组V1/2升高[（-24.20±0.35）mV 比（-10.04±0.33）mV，P <0.05]，激活曲线左移，激活加快；与H/R 组比较，T3+H/R 组[（-16.39±0.53）mV]的V1/2减小（P<0.05），激活曲线右移，激活减慢。各组K 值差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 各组乳小鼠心室肌细胞L-钙离子通道稳态失活曲线及稳态激活曲线

2.3 PI3K/Akt 信号通路在T3对心肌细胞H/R 损伤中的作用

与Control 组比较，H/R 组心肌细胞P-PI3K 及P-Akt 表达减少（P <0.01）；与H/R 组比较，T3+H/R组心肌细胞P-PI3K 及P-Akt 表达增加（P ＜0.01），H/R+LY 组心肌细胞P-PI3K 及P-Akt 表达减少（P ＜0.01）；与T3+H/R 组比较，T3+H/R+LY 组心肌细胞P-PI3K及P-Akt 表达减少（P ＜0.01）。见图3。

图3 Western blot 检测H/R 模型和T3对PI3K/Akt 信号通路表达的影响

3 讨论

钙离子作为第二信使，在细胞病理和生理过程中起着重要作用，心肌细胞钙离子的转运调节心肌收缩与舒张。本实验利用全细胞膜片钳技术，证实H/R可显著降低ICaL。很多文献已经报道T3对心血管的保护作用[1-2]，本实验发现T3可以有效抑制H/R 诱导的钙离子通道损伤，保护心肌细胞L-型钙离子通道，且保护作用可通过激活PI3K/Akt 信号通路来实现。

急性心肌梗死后容易并发缺血再灌注损伤，后者可以诱发一系列病理过程，如线粒体膜电位的损伤，细胞内钙超载，氧化应激产物的形成等，这些会诱导心律失常、微循环障碍的发生，甚至最终造成严重的心力衰竭[6-7]。有研究表明，胞浆钙离子的释放不仅通过心肌肌浆网Ca2+-ATP 酶2a（SERCA2a），也通过Na+-Ca2+交换[8-9]。缺血再灌注损伤可导致Na+-Ca2+交换增加有关并诱导细胞内钙超载[6]。研究显示，缺血再灌注损伤时心肌细胞动作电位时程缩短，导致心肌细胞动作电位的不均一性，诱发折返性心律失常[10]。本实验利用膜片钳技术记录H/R 损伤后的细胞钙离子，发现L-型钙离子通道受到抑制，峰值电流较正常心肌细胞明显下降，I-V 曲线上移，与之前的研究一致[10-12]。

甲状腺激素可以调节心肌收缩蛋白及钙处理蛋白的表达，调节心肌细胞离子通道及交感神经兴奋系统在心血管系统中的表达[13]。既往有研究显示，急性心肌梗死常伴随着体内甲状腺激素水平的改变[13-14]，大量报道也证实，急性心肌梗死后运用低剂量T3可以促进心功能恢复并减轻心室重塑[1-2]，T3可以激活Akt并保护心功能[15-18]。本实验通过T3预处理证实T3可以减轻H/R 对ICaL的抑制，恢复部分上移的I-V 曲线，恢复左移的激活曲线，使激活减慢，恢复右移的失活曲线，使失活加快。PI3K/Akt 是细胞的重要信号通路，在调节细胞凋亡、细胞增殖、自噬、分化等方面均发挥重要作用[3，19]，激活这一通道能保护心肌并减少缺血再灌注引起的损伤[3]。在本实验中，H/R 损伤可减少PI3K/Akt 信号通路的激活，而T3预处理可显著增加P-PI3K 和P-Akt 的表达。当加入PI3K/Akt 特异性通道阻滞剂后，T3对ICaL的作用被明显抑制，证明T3通过激活PI3K/Akt 信号通路发挥作用。有研究显示，Akt 的激活可以增加ICaL[20]，本实验通过抑制PI3K/Akt 信号通路发现T3对L-型钙离子通道的作用可能是由PI3K/Akt 信号通路来发挥的。

综上，H/R 损伤导致心肌细胞ICaL下降，T3可以保护L-型钙离子通道，减少通道电流的下降，其可能是通过PI3K/Akt 信号通路来发挥作用的。