天山堇菜总黄酮抗菌、抗炎、解热、镇咳作用研究

王 雪 史玉柱 司丽君 赵丽娟 马雪萍 黄 华

新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐 830004

天山堇菜Viola thianschanica Maxim.是堇菜科（Violaceae）植物，药用其全草，具有清热解毒的作用[1]，临床上主要用于感冒、发烧、头痛、咽痛等，也可外用于疔疮肿痛等症。天山堇菜含挥发油、黄酮类、生物碱等成分，具有明显的抗菌、抗氧化[2-4]等作用。本课题组已经完成了天山堇菜总黄酮制备工艺，测得总黄酮含量为52%（文献尚未发表）。本研究考察了天山堇菜总黄酮体内、外抗菌、抗炎、解热和镇咳作用，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

KM 小鼠（体重18～22 g）、Wistar 大鼠（体重180～200 g）均购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，许可证号分别为SCXK（新）2016-0003、SCXK（新）2016-0001。动物实验研究严格遵循有关实验动物保护和使用指南，并经新疆维吾尔自治区药物研究所实验动物伦理委员会批准。

1.2 药品与试剂

天山堇菜总黄酮，总黄酮含量为52%，新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学室制备，批号：20 180116；复方一枝蒿颗粒，规格5 g/袋，即30 g/（人·d），新疆银朵兰维药股份有限公司，批号： 180358；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

SW-CT-IF 超净化工作台，苏净集团安泰空气技术有限公司；YP 型电子天平（0.1 g），上海菁海仪器有限公司；YLS-8A 多功能诱咳引喘仪，山东省医学科学院设备站；SIM-SIR 独立换气系统笼具，成都达硕实验动物设备有限公司。

1.4 实验菌种和培养基

金黄色葡萄球菌（批号：ATCC25923）、大肠埃希菌（批号：ATCC25922）均购于中国食品药品检定研究院。M-H 琼脂培养基，杭州微生物试剂有限公司，批号：20090305-00。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 天山堇菜总黄酮体外抗菌试验 培养基制作：M-H 琼脂培养基经122℃高压灭菌，分别分装于无菌试管及无菌培养皿内，每支试管0.9 mL，每个培养皿10 mL。参照文献[5-8]采用试管稀释法和平皿琼脂稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。37℃培养24 h 后，肉眼观察细菌生长情况。与药液对照管比较，若加入细菌的药液管仍澄清，则表示无细菌生长，说明该管药物有抗菌作用；若浑浊，则表明细菌已生长，该药物无抗菌作用。以完全无细菌生长的最低药物浓度作为细菌对该药物的敏感度，即为该药物的MIC。观察药物MIC 以上的无细菌生长的加药管，分别吸取0.1 mL 培养物移种至平皿琼脂培养基上，推开药液，37℃过夜，观察计数平皿培养基中细菌菌落数，＜5 个菌落的药物浓度为该药物的MBC。

1.5.2 体内抑菌实验 确定菌液感染浓度：KM 小鼠，实验动物质量合格证号：65000700000816。小鼠腹腔注射不同浓度的大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌的菌悬液，0.5 mL/只，每个浓度组5 只小鼠，观察记录7 d内小鼠的死亡情况，选择能引起小鼠80%以上死亡的浓度为该菌液最佳感染浓度。正式实验：KM 小鼠100 只，雌雄各半。50 只用于观察对大肠埃希菌感染小鼠的存活率，实验动物质量合格证号：65000700000 898；50 只用于观察对金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率，实验动物质量合格证号：65000700000906。依体重、性别随机均衡分为模型组、复方一枝蒿颗粒组（5.0 g/kg）和天山堇菜总黄酮0.08、0.16、0.32 g/kg 组，每组10 只。各组均按设定剂量灌胃给药，模型组给予0.5%的羧甲基纤维素钠混悬液，连续3 d 给药。末次给药后1 h，各实验组小鼠腹腔注射能引起80%以上小鼠死亡的菌液，每只0.2 mL。参照文献[5-6]的方法，记录每组小鼠的死亡数，并计算死亡率。

1.5.3 天山堇菜总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响KM 小鼠50 只，实验动物质量合格证号：6500070000 0950。分组及给药同“1.5.2”，给药后1 h，参照文献[5-12]的方法进行实验，计算肿胀度（左右耳片质量之差）和肿胀抑制率。

1.5.4 天山堇菜总黄酮对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响 KM 小鼠50 只，实验动物质量合格证号：65000700000918。分组及给药同“1.5.2”。参照文献[5-9]的方法进行实验，计算药物对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的抑制率。

1.5.5 天山堇菜总黄酮对浓氨水致小鼠咳嗽反应的影响 KM 小鼠50 只，实验动物质量合格证号：6500070 0000958，分组及给药同“1.5.2”。参照文献[13-15]的方法进行实验，观察记录小鼠的咳嗽潜伏期和2 min 内咳嗽次数。

1.5.6 解热作用 Wistar 大鼠40 只，实验动物质量合格证号：65000200000861，体重180～200 g，将其随机分为模型组、复方一枝蒿颗粒组（2.73 g/kg）和天山堇菜总黄酮0.07、0.14、0.28 g/kg 组，每组8 只。各给药组均按设定剂量灌胃给药，模型组给予0.5 % CMCNa，每天1 次，连续3 d。末次给药前，依参照文献[5]和文献[16-22]的方法建立发热模型，记录造模后4、6、8、10 h 的体温值，并计算其与基础体温的差值（△T）。

1.6 统计学方法

数据处理采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。计数资料采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抑菌试验

实验菌稀释浓度见表1。天山堇菜总黄酮、复方一枝蒿对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC 值见表2。

表1 天山堇菜总黄酮体外抑菌实验菌浓度（×107 CFU/mL）

表2 天山堇菜总黄酮、复方一枝蒿对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC、MBC 值（mg/mL）

2.2 体内抑菌试验

天山堇菜总黄酮0.32 g/kg 可明显降低大肠埃希菌感染小鼠模型和金黄色葡萄球菌感染小鼠模型的死亡率（P ＜0.05）。见表3～4。

表3 天山堇菜总黄酮对大肠埃希菌感染小鼠死亡率的影响

表4 天山堇菜总黄酮对金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率的影响

2.3 天山堇菜总黄酮对小鼠耳肿胀的影响

与模型组比较，天山堇菜总黄酮0.16、0.32 g/kg组耳肿胀程度明显减轻（P ＜0.05 或P ＜0.01），耳肿胀抑制率分别为22.3%、31.6%。见表5。

2.4 天山堇菜总黄酮对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

与模型组比较，复方一枝蒿颗粒组、天山堇菜总黄酮各剂量组均可显著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高（P ＜0.05）。见表6。

表5 天山堇菜总黄酮对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

表6 天山堇菜总黄酮对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响

2.5 天山堇菜总黄酮对氨水致小鼠咳嗽反应的影响

与模型组比较，复方一枝蒿颗粒组和天山堇菜总黄酮各剂量组均可明显减少氨水引起的小鼠咳嗽反应次数（P ＜0.05 或P ＜0.01），天山堇菜总黄酮0.16、0.32 g/kg 组可显著延长咳嗽潜伏期（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表7。

表7 天山堇菜总黄酮对氨水致小鼠咳嗽反应的影响（）

表7 天山堇菜总黄酮对氨水致小鼠咳嗽反应的影响（）

注：与模型组比较，**P ＜0.01，*P ＜0.05。“-”表示无数据

2.6 天山堇菜总黄酮对干酵母致大鼠发热反应的影响

与模型组比较，天山堇菜总黄酮0.14 g/kg 组在给予干酵母造模后6～8 h 降温效果明显（P ＜0.05），天山堇菜总黄酮0.28 g/kg 组在造模后6 h 具有显著降温作用（P ＜0.05）。见表8。

3 讨论

本研究测得天山堇菜总黄酮对大肠埃希菌的MIC 和MBC 分别为0.49、0.98 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC 和MBC 分别为1.95、3.90 mg/mL，说明其具有明显的抗菌作用，同等实验条件下，其抗菌作用强于阳性对照药复方一枝蒿。小鼠耳肿胀模型和腹腔毛细血管通透性增高模型都是常规筛选抗炎药物的模型，通过这两个模型，本研究发现天山堇菜总黄酮0.16、0.32 g/kg 剂量均具有明显的抗炎作用。在大鼠发热模型中，本研究发现天山堇菜总黄酮0.14 g/kg 在造模后6、8 h 具有明显的解热作用，0.28 g/kg 在造模后6 h 也具有较好的解热作用。在氨水引咳实验中，天山堇菜总黄酮三个剂量组均具有明显的镇咳作用。以上实验结果表明，天山堇菜总黄酮提取物具有较好的抗菌、解热、镇咳、抗炎作用，并且其体内外抗菌作用优于阳性对照药复方一枝蒿颗粒。

表8 天山堇菜总黄酮对干酵母致大鼠发热反应的影响（）

表8 天山堇菜总黄酮对干酵母致大鼠发热反应的影响（）

注：与模型组比较，*P ＜0.05。“-”表示无数据

复方一枝蒿可解表祛风，凉血解毒，广泛应用于邪毒所致的感冒发烧、咽喉肿痛、病毒性感冒等[23]。天山堇菜作为特色民族药材具有疗效确切、安全有效的特点。复方天山堇菜颗粒、复方比那甫西丸、降热比那甫西糖浆在新疆民间被广泛应用来治疗感冒等呼吸道传染病，以上经典名方的君药均为天山堇菜。但天山堇菜抗流感方面的研究却鲜有报道，基于民间临床用药经验及相关文献[1-4]，本研究前期发现天山堇菜总黄酮提取物具有较好的抗甲型流感病毒活性，在防治流感方面具有广阔的应用前景[24]。本研究通过对经典的炎症、咳嗽和解热模型的复制，以具有广泛应用基础的抗流感药物复方一枝蒿颗粒为阳性对照药，发现天山堇菜总黄酮不仅具有抑制炎症的作用，还可有效缓解感染引起的发热、咳嗽等症状，此外，还具有较好的抗菌作用。本研究为天山堇菜在防治流感方面的应用提供了充分的实验室依据，为进一步将其开发为抗流感病毒药物奠定了基础。