UPLC-DAD 法快速检测保健食品中13种非法添加化学物质

赵 琪，贾昌平，钱叶飞，陈丽波

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州215104）

保健食品是指一类具有特定保健功能的食品，供特定人群使用以调节机体，却不能以治疗疾病为目的［1］。缓解体力疲劳类保健食品中非法添加药物最常见的是PDE-5抑制剂［2-3］，而近年来新的添加成分层出不穷，一些不法商贩为了牟取暴利，在这类产品中添加化学药品甚至是合成中间产物［4-5］，从而提高产品的疗效，谋求暴利。这类非法添加的化学物质若长期使用，非但起不到强身健体的效果，甚至会损害人体健康［6］。

国家食品药品监督管理局颁布的现行检验标准中涉及11种PDE-5选择性抑制剂［7］，为规避检查，不法生产者采取添加标准外的物质［8］，除西地那非的其他类似物之外，课题组在缓解体力疲劳类保健食品中首次检出对乙酰氨基酚以及西地那非杂质12。对乙酰氨基酚是一类非甾体类抗炎药，在临床上用于抗炎镇痛类化学药品中［9］，且大剂量使用会存在一定的不良反应［10］。

目前，在缓解体力疲劳类保健食品中非法添加化学药物的检测中，液相色谱-串联四级杆质谱法（HPLC-MS／MS法和UPLC-MS／MS 法）的应用较多［11-14］，但由于违禁成分添加量通常较大，容易导致质谱污染，检测结果出现假阳性；以及原国标方法中的HPLC 法出峰慢、时间长、不利于快速定性、定量［15］。因此需建立一种高效检测方法。本研究参考国家食品药品监督管理局文件中规定的11种那非类化药的检测方法，使用UPLC 进行快速定性、定量。并做了方法学考察，最后使用该方法进行多批样品检测，以期实现此类非法添加化学药物的快速筛查，为进一步的质谱确证提供有力的保障。

1 材料

1.1 仪器 KQ-300DA 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Synergy system 型超 纯水仪（美国Millipore 公司）；TZL-5009型可调速漩涡混匀器；Heraeusbiofuge primor 型高速离心机（美国Thermo 公司）；Waters ACQuity UPLC 超高效液相色谱仪，配有2998型二极管阵列检测器（美国Waters 公司）。

1.2 试药 实测样品来自苏州市食品药品监督管理局抽检样品。

对照品盐酸育亨宾（批号Y100800，含有量100%）购于（TRC 加拿大化工公司）；那红地那非（批号1591-080A3，含有量99.2%）、红地那非（批号1218-018A12，含有量99.1%）、伐地那非（批号1132-035A1，含有量99.5%）、豪莫西地那非（批 号1220-030A3，含有量98.7%）、氨基他达拉非（批 号1638-004A2，含有量99.9%）、他达拉非（批号1156-051A1，含有量99.7%）、硫代艾地那非（批号1214-006A3，含有量99.5%）、伪伐地那非（批号1217-011A2，含有量99.5%）、那莫西地那非（批号1320-054A2，含有量99.9%）、西地那非杂质12（批号2478-038A2，含有量99.1%）均购于（加拿大TLC Pharmachem 公司）；西地那非（批号510068-201401，含有量100.0%）、对乙酰氨基酚（批号100018-201610，含有量100%）均购于中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈和乙酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯；实验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Luna UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相甲醇（A）-乙腈（B）-磷酸三乙胺溶液（C），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.3 mL／min；检测波长200～400 nm；柱温30 ℃；样品室温度室温；进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

2.2.1.1 对照品贮备液 精密称取那红地那非及其相应的对照品约5 mg，置10 mL 量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度约为0.5 mg／mL 的对照品贮备液，于-20 ℃冰箱中保存。

2.2.1.2 混合对照品溶液 取“2.2.1.1”项下对照品贮备液（0.5 mg／mL）各100 μL 于5 mL 量瓶中，加乙腈定容至5 mL，混匀，即得13种对照品混合溶液。

2.2.1.3 检出限溶液配制 取混合对照品溶液100 μL，置于5 mL 量瓶中，用磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（60 ∶20 ∶20）溶液定容至5 mL，作为检出限溶液。

2.2.2 供试品溶液 取1次口服量样品，研磨研细后，精密称取细粉适量（约相当于1次服用量），置10 mL 量瓶中，加乙腈至10 mL，超声20 min，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，于14 000 r／min 离心5 min，上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2.3 空白样品溶液 不加样品，按“2.2.2”项下方法制备空白样品溶液。

2.3 专属性试验 取“2.2.1”项下对照品溶液各适量，在“2.1”项条件下进样0.5 μL。记录色谱图和各物质的紫外吸收光谱图见图1～2，从色谱图中可以看出13种标准物质均达到基线分离。

图1 各物质UPLC 色谱图（230 nm）

2.4 线性关系考察 将上述“2.2.1”中配制好的混合对照品贮备液逐级稀释 成2.5、5.0、10.0、25.0 μg／mL、50.0 μg／mL，将系列不同质量浓度的混合标准溶液进样测定，记录色谱图，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性拟合，从而得到线性方程和相关系数。13种化合物的线性范围为2.5～50.0 μg／mL。相关系数均在0.9990及以上，各分析物在各自范围内线性关系良好，见表2。

2.5 定量、检测限 分别精密量取“3.1”项下混合对照品溶液，用阴性样品溶液等倍逐步稀释，在“2.1”项条件下进样1 μL，记录峰高。当信噪比为10 ∶1时，得定量限；当信噪比为3 ∶1时，得检测限，见表2。

表2 各对照品线性关系及检出、定量限

2.6 精密度试验 将混合对照品溶液在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，测得各物质色谱峰面积RSD 均小于2%，表明仪器精密度良好。

图2 各对照品紫外吸收光谱图（230 nm）

2.7 稳定性试验 取质量浓度为50.0 μg／mL 的混合对照品溶液及供试品溶液（MAXMAN coffee），于自动进样器中，分别于1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项条件下进样，记录峰面积，他达拉非峰面积的RSD 值小于2.0%。表明对照品溶液及供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验 精密称取同一批样品（MAXMAN coffee）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，在“2.1”项条件下进样，测得他达拉非峰面积RSD小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 以不含非法添加化学物质的缓解体力疲劳类保健食品为基质，在1个添加水平进行回收率测定，使回收率溶液最终质量浓度为2.5 μg／mL，平行制备6份，进样，分析。得13种物质的平均加样回收率在94.68%～115.30%之间，RSD 小于6%。

2.10 样品含有量测定 按“3.2”项下方法处理样品，在“2.1”色谱条件下进样测定。本实验选择了市售及查获的缓解体力疲劳类保健食品进行检测，对实验结果综合保留时间及其光谱图对样品进行筛查，并通过外标法对检出的化学成分定量。结果表明，4批检出西地那非，1批检出他达拉非，1批检出氨基他达拉非，2批检出西地那非杂质12，2批检出对乙酰氨基酚，3批未检出，阳性样品均已通过UPLC-MS／MS 确证。见表3、图3。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 原国标方法中甲醇-乙腈-0.7% 三乙胺水溶液20 ∶20 ∶60（磷酸调pH 至2.0），出峰快，那非类物质分离效果不佳。通过降低初始有机相比例，提高水相比例，将13种物质尤其是那非类出峰延后，达到了较好的分离效果。此外，水相添加剂的选择考察了甲酸、乙酸，二者对于那非类分离效果不如0.7%三乙胺水溶液的洗脱性好，故水相仍沿用国标中0.7%三乙胺水溶液。

表3 样品信息及测定结果

图3 MAXMAN coffee UPLC 色谱图（230 nm）

其次，色谱柱柱温的高低会对缓解体力疲劳类非法添加化学物质的分离效能和分析速度产生影响。本实验分别考察柱温20、25、30、35、40 ℃的分离情况，20、25 ℃柱温接近室温，受室温影响，温度有可能会有波动，对分离效果改善也不理想；35、40 ℃对那非类的分离并没有起到正向的作用，故最终确定柱温30 ℃。

选择了粒径、长度相似的常规C18色谱柱，分别是Waters UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、LUNA UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）以及Agilent ZORBAX Eclipse plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。其中LUNA UPLC C18柱相较前两者来说，在同样的流动相比例及相同柱温条件下，对于那非类化合物分离效果更好。

3.2 优势和不足 本实验所建立的方法适用于缓解体力疲劳类保健食品中非法添加化学物质的初步筛查，对阳性的结果还需进行质谱确证。由于质谱仪灵敏度高，在样品前处理中容易导致交叉污染，故在实际检验工作中需要利用灵敏度较低的紫外检测器做初步判别。本实验建立的UPLC-DAD 法可满足保健食品的初筛及定量要求，较质谱法更利于推广。

4 结论

本研究根据实际检测工作的需要以及前期实验的积累，建立了一种快速筛查方法。涉及13种化学物质并具有一定的代表性。优化后的方法较原国标方法在时间上缩短至20 min，大大提高了检测效率、降低了检出限、提高了灵敏度、减少假阳性的风险；其次，出峰快体积流量小、节省流动相，更环保。该方法适用于保健食品中非法添加药物的初步筛查及阳性药物的定量检测，已用于日常检验工作中，尤其在承接公安办案类应急检测中，缩短检测时间，有力的提升了检验效率。