一测多评法同时测定安中片中8种成分

谭丙寅，吴明波，袁芳杰∗

（1.武汉市第四医院，湖北 武汉430034；2.武汉启瑞药业有限公司，湖北 武汉430062）

安中片收载于2015年版《中国药典》 一部，具有温中散寒、理气止痛、和胃止呕的功效，临床上主要用于阳虚胃寒所致的胃痛，症见胃痛绵绵、畏寒喜暖、泛吐清水、神疲肢冷，以及慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡见上述证候的治疗［1］，由桂枝、高良姜、延胡索（醋制）、牡蛎（煅）、小茴香、砂仁、甘草7味药材加工而成，但现行质量标准仅对方中使药甘草中甘草酸含有量进行测定，前期也仅检索到单一成分定量测定的报道［2-4］。

中成药复方制剂所含成分复杂，仅检测单一成分难以全面准确评价其质量，故多成分、多指标模式已成为其质量控制的必然趋势，但所用对照品存在稳定性差、难以制备、价格昂贵等不足。一测多评法通过测定1种稳定易得价廉的对照品，利用中药成分之间存在的函数关系实现多种成分同时测定，大大降低了检验成本，现已逐步应用于中成药复方制剂中。因此，本实验采用该方法，以延胡索乙素为内标，建立其与肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、紫堇碱、四氢小檗碱的相对校正因子，并测定安中片中各成分含有量，以期为该制剂质量控制方法的提升提供实验依据。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配置Waters e2695型液相色谱仪；BP211D型电子天平（德国Sartorius 公司）；SB25-12DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。肉桂酸（110786-201604，含有量98.8%）、桂皮醛（110710-201821，含有量99.6%）、高良姜素（111699-201703，含有量99.6%）、原阿片碱（110853-201805，含有量99.6%）、延胡索乙素（110726-201819，含有量99.8%）对照品购自中国食品药品检定研究院；肉桂醇（104-54-1，含有量98.0%）、四氢小檗碱（522-97-4，含有量98.0%）对照品购自上海纯优生物科技有限公司；紫堇碱（518-69-4，含有量99.0%）对照品购自上海卡努生物科技有限公司。安中片（0.2 g／片，批号18030015、18070137、18110224）购自太极集团重庆桐君阁药厂有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱［5-7］（0～12.0 min，28.0% A；12.0～27.0 min，28.0%～49.0% A；27.0～36.0 min，49.0%～67.0%A；36.0～58.0 min，67.0%～81.0%A；58.0～65.0 min，81.0%～28.0%A）；检测波长280 nm［2，7-8］；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为0.196、0.734、6.342、3.538、0.312、0.954、0.798、0.532 mg／mL 的贮备液，各精密吸取2.5 mL置于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（肉桂醇9.80 μg／mL、肉桂酸36.7 μg／mL、桂皮醛317.1 μg／mL、高良姜素176.9 μg／mL、原阿片碱15.6 μg／mL、延胡索乙素47.7 μg／mL、紫堇碱39.9 μg／mL、四氢小檗碱26.6 μg／mL）。

2.3 线标溶液制备 精密吸取8种对照品贮备液各5.0 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成线标溶液Ⅰ，精密吸取适量，依次用甲醇稀释2、4、8、16、20倍，分别作为溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

2.4 供试品溶液制备 取片剂适量，研细，精密称取约3.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（500 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.5 阴性样品溶液制备 按照片剂处方及工艺，分别制备不含桂枝、高良姜、延胡索的阴性样品，按“2.5”项下方法制备，即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分分离度良好（均大于1.5），理论塔板数均不低于4 000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.6.2 线性关系考察 精密吸取“2.4”项下线标溶液Ⅰ～Ⅵ适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱峰面积RSD 分别为1.22%、1.03%、0.56%、0.64%、1.15%、0.71%、0.85%、1.01%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取同一片剂（批号18030015），按“2.5”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样，测得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱含有量RSD 分别为0.89%、1.76%、1.37%、0.45%、0.83%、1.65%、0.78%、1.86%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样，测得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱峰面积RSD 分别为1.27%、1.06%、0.54%、0.61%、1.11%、0.69%、0.81%、0.99%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.6 加样回收率试验 取含有量已知的片剂适量，研细，精密称取约1.5 g，共9份，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（肉桂醇0.122 mg／mL、肉桂酸 0.494 mg／mL、桂皮醛4.788 mg／mL、高良姜素2.294 mg／mL、原阿片碱0.176 mg／mL、延胡索乙素0.718 mg／mL、紫堇碱0.544 mg／mL、四氢小檗碱0.372 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL，各3份，按“2.5”项下方法制备9份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱平均加样回收率分别为96.98%、98.62%、99.24%、99.80%、97.63%、98.99%、98.39%、97.80%，RSD 分别为1.24%、1.41%、0.94%、0.70%、1.57%、1.18%、0.89%、1.06%。

2.7 相对校正因子计算 精密吸取“2.4”项下制备6个线标溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以延胡索乙素为内标，计算其他7种成分相对校正因子，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.8 耐用性考察

2.8.1 仪器、色谱柱 考察Agilent 1260、Waters e2695高效液相色谱仪，以及Diamonsil C1、Agilent Extend-C18、Hypersil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.8.2 体积流量 考察0.8、0.9、1.0 mL／min 体积流量对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响。

表4 不同体积流量测得的相对校正因子Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.8.3 柱温 考察28、30、32 ℃柱温对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.9 色谱峰定位 取“2.5”项下供试品溶液，分别在“2.8.1”项色谱仪、色谱柱下测定，以延胡索乙素为内标，计算其他7种成分相对保留时间，结果见表6，可知均无明显影响。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.10 样品含有量测定 取3批片剂，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表7，可知2种方法所得结果无明显差异。

表7 各成分含有量测定结果（mg／片）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／tablet）

3 讨论

3.1 指标成分选择 安中片中高良姜温中暖胃，散寒止痛，为君药；桂枝、小茴香助高良姜温里散寒止痛，为臣药；延胡索行气止痛，煅牡蛎敛酸止痛，砂仁温中健脾，共为佐药；甘草调和诸药，为使药。依据中药质量标志物［9-10］以君药为主，兼顾臣、佐、使药的优选原则，为了全面地评价安中片质量均一性，确保临床疗效一致性，本实验选择君药高良姜代表性成分高良姜素，臣药桂枝主要成分肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛，佐药延胡索主要成分原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱作为指标成分。

3.2 检测波长选择 采用DAD 检测器，在200～400 nm 波长范围内进行扫描，发现肉桂醇在275 nm，肉桂酸在276 nm，桂皮醛在289 nm，高良姜素在266 nm，原阿片碱在288 nm，紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱在280 nm 处有最大吸收。然后，比较样品溶液在266～289 nm 波长范围内的色谱图，发现在280 nm 处效果最佳，故选择其作为检测波长。

3.3 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了提取溶 剂（75% 甲 醇、甲 醇［2，4-5，11-13］、70% 乙 醇［8］、乙醇），发现甲醇提取时各成分综合提取率最佳。在此基础上，又考察了提取方式（超声［2，4-5，8，11-12，14］、回流［6-7，15］提取），发现2种提取方法下各成分提取率差异不大，但后者杂质成分相对较多，故选择前者作为提取方式。同时，又考察了提取时间（20、30、40 min）。最终确定，供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定安中片中肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱的含有量，实现了该制剂多指标成分控制的目的，而且该方法操作简便，重复性好，可为其质量评价提供参考依据。