葫芦素B 磷脂复合物纳米结构脂质载体的制备

胡瑞瑞，张家梁，郝海军

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州450064；2.河南应用职业技术学院，河南 郑州450042；3.上海雷允上药业有限公司技术中心，上海201401）

葫芦素B 是从葫芦科植物甜瓜Cucumis meloL.中提取分离得到的一种四环三萜类成分，具有抗肿瘤、抗炎、保肝等多种药理活性［1-3］，但其水溶性极差，导致体内吸收困难［4-5］。磷脂复合物可改善难溶性成分溶解度问题［6-8］，从而促进胃肠道吸收，万露等［6］报道，葫芦素B 磷脂复合物可显著增强其抗肿瘤作用，但该技术存在疏水性强、分散性及溶出度差等缺点［9］。

纳米结构脂质载体是在固体脂质纳米粒［10-11］基础上发展起来的新剂型，具有稳定性好、载药量高等优势［12］。为了改善葫芦素B 磷脂复合物疏水性强、溶出困难等缺点，本实验将其制成纳米结构脂质载体，并优化处方，考察其粒径、Zeta 电位、包封率、载药量、体外释放度、体内药动学行为，为该成分相关制剂的研发提供新策略。

1 材料

U3000型高效液相色谱仪（戴安中国有限公司）；SOP 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；DF-101S 型磁力搅拌器（巩义市豫华仪器有限公司）；JY92-II 型超声波细胞粉碎仪（宁波新知科仪器研究所）；XW-80A 型涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；RC-6型溶出仪（天津新天光分析仪器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析仪（英国Malvern 公司）。

葫芦素B 对照品（批号150520，上海源叶生物科技有限公司）；葫芦素B 原料药（含有量98.3%，批号20161210S，上海中药研究所）；单硬脂酸甘油酯（型号Kolliwax GMS）、泊洛沙姆188（型号WPEE587E）（德国巴斯夫公司）。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含有量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（45 ∶55）；检测波长229 nm；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 供试品溶液制备 精密量取纳米结构脂质载体混悬液0.5 mL，加入1 mL 甲醇超声5 min，12 000 r／min 离心45 min，精密量取0.5 mL 置于10 mL 量瓶中，定容，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密称取真空干燥过夜后葫芦素B 对照品15.0 mg，置于100 mL 量瓶中，适量甲醇超声溶解后静置至室温，定容至刻度，取适量用甲醇进一步稀释成0.05、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 μg／mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进 行回归，得到方程Y=2.140 6X＋0.036 8（r=0.999 9），在0.05～100.0 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 取 0.05、50.0、100.0 μg／mL葫芦素B 对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得葫芦素B 峰面积RSD 分别为0.31%、0.25%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得葫芦素B 峰面积RSD 为0.61%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 精密量取0.5、50.0、100.0 μg／mL 葫芦素B 对照品溶液各0.5 mL，加入0.5 mL 空白纳米结构脂质载体中，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，葫芦素B 平均加样回收率分别为98.31%、98.03%、98.82%，RSD 分别为1.12%、0.61%、0.73%。

2.2 磷脂复合物制备、纯化及复合率测定［6］称取葫芦素B 1.12 g、大豆卵磷脂1.6 g，置于含400 mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，于50 ℃、1 200 r／min 条件下搅拌4 h，0.45 μm 微孔滤膜过滤，除去未参加复合反应的游离葫芦素B，减压旋蒸除去四氢呋喃，即得磷脂复合物粗品，再加入约50 mL 无水乙醇溶解，减压旋蒸除去无水乙醇及残留的四氢呋喃，真空干燥箱中过夜干燥，即得浅黄色、半固体状态的纯品。

然后，取50 ℃下1 200 r／min 搅拌4 h 后的溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，精密测定体积（V1），在“2.1.1”项色谱条件下进样测定葫芦素B 质量浓度（C1），计算形成磷脂复合物的葫芦素B 用量W1（C1×V1），再以W1与初始葫芦素B 投药量（W0）的比值计算复合率。结果，葫芦素B 复合率为（99.82 ± 0.13）%，质量分数为（40.34 ±0.21）%。

2.3 纳米结构脂质载体制备［12］称取磷脂复合物、单硬脂酸甘油酯、油酸适量及甲醇10 mL，置于20 mL 圆底烧瓶中，70 ℃水浴溶解，作为油相；配制20 mL 泊洛沙姆188溶液，加热至70 ℃，作为水相，于1 200 r／min 搅拌速度下将水相缓慢加到油相中（用时约5 min），敞口继续搅拌3 h，得到初乳，将其置于冰水混合物中继续搅拌1.5 h后，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得（2.13 mg／mL）。同法制备不含葫芦素B 的空白纳米结构脂质载体。

2.4 包封率、载药量测定 采用超滤离心法。精密量取1.0 mL 混悬液置于超速离心管中（截留分子量8 000～14 000 Da），10 000 r／min、4 ℃条件下离心45 min，测定滤液中葫芦素B 含有量（m游离）；精密量取1.0 mL 混悬液于10 mL 量瓶中，甲醇超声后定容，测定葫芦素B 总含有量（m总量）。再计算包封率及载药量，公式为包封率=［（m总量-m游离）／m总量］×100%、载药量=［（m总量-m游离）／（m总脂质＋m总量）］×100%，其中m总脂质表示纳米结构脂质载体总质量。

2.5 处方优化 在前期单因素试验的基础上，以脂质用量（A）、固液脂质比（B）、投药量（C）、乳化剂浓度（D）为影响因素，包封率为评价指标，设计L9（34）正交设计表。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。由表2可知，各因素影响 程度依次为A ＞B ＞D ＞C，最优处方为A1B1C2D2，即脂质用量350 mg，固液脂质比5 ∶1，投药量为45 mg，乳化剂浓度1.0%。

2.6 冻干粉制备 取2 mL 纳米结构脂质载体混悬液于10 mL 西林瓶中，加入5% 冻干保护剂甘露醇，振荡溶解后置于-75 ℃冰箱中预冻12 h 后取出，置于冻干机（起始温度-45 ℃）2.5 h 后抽真空，以4 ℃／h 速率升温至-10 ℃，持续36 h，即得。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.7 冻干粉表征

2.7.1 粒径 取冻干前后样品，蒸馏水适当稀释，测定其粒径，结果见图1。由图可知，冻干前平均粒径为（206.27 ± 4.93）nm，PDI 为0.167 ±0.030，而冻干后两者分别为（224.36±8.14）nm、0.203±0.039。

图1 纳米结构脂质载体粒径Fig.1 Particle sizes of nanostructured lipid carriers

2.7.2 Zeta 电位 取冻干前后样品，蒸馏水适当稀释，测定其Zeta 电位，结果见图2。由图可知，冻干前平均Zeta 电位为-（9.44±0.22）mV，而冻干后为-（8.11±0.28）mV。

2.7.3 包封率、载药量 取冻干前后样品，按“2.4”项下方法测定，结果见表4。由表可知，冻干过程并未破坏纳米结构脂质载体的微观结构。

图2 纳米结构脂质载体Zeta 电位Fig.2 Zeta potentials of nanostructured lipid carriers

表4 纳米结构脂质载体包封率、载药量Tab.4 Encapsulation efficiencies and drug loadings of nanostructured lipid carriers

2.8 体外释药行为 蒸馏水配制供试品溶液（原料药、磷脂复合物、纳米结构脂质载体，以葫芦素B 用量计为40 mg），置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），两端扎紧，以900 mL 超声后的蒸馏水为溶出介 质，转速100 r／min，温度（37±1）℃，于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h各取样2.0 mL，同时补充2.0 mL 释放介质，测定葫芦素B 含有量，绘制体外释放曲线，结果见图3。由图可知，原料药24 h 内累积溶出度仅为35.64%；磷脂复合物24 h 内累积溶出度也较低，但比原料药略高，可能与其本身疏水性强、分散性较差有关［13］；纳米结构脂质载体在24 h 内累积释放度达73.11%，明显高于原料药及其磷脂复合物。

图3 样品体外释药曲线Fig.3 In vitro drug release curves for samples

2.9 药动学行为

2.9.1 灌胃液制备 取原料药、磷脂复合物、纳米结构脂质载体冻干粉适量，置于蒸馏水中，超声分散约30 s，即得（含葫芦素B 5 mg／mL）。

2.9.2 给药及取血［11］取18只大鼠（雌雄兼具），随机分为3组，每组6只，实验前及实验过程中禁食，自由饮水，分别给予原料药、磷脂复合物、纳米结构脂质载体混悬液，给药剂量以葫芦素B 计均为10 mg／kg，于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、10、12、16 h 眼眶后静脉丛取血，血样置于肝素浸润的离心管中，3 000 r／min 离心3 min，保存于-20 ℃冰箱中。

2.9.3 供试品溶液制备 精密吸取血浆200 μL 于离心管中，加入1.2 mL 乙腈，涡旋混匀5 min 后8 000 r／min 离心15 min，吸取上清液，转移至空白离心管中，35 ℃氮气缓慢吹去有机溶剂，残留物用200 μL 乙腈复溶，8 000 r／min 离心5 min，取上清液进样测定。

2.9.4 线性关系考察 取“2.1.3”项下25.0 μg／mL葫芦素B 对照品溶液，乙腈逐步稀释制成0.25、2.5、5、10、12.5、25 μg／mL，各精密吸取200 μL，35 ℃氮气缓慢吹去有机溶 剂，加入200 μL空白血浆，涡旋混匀10 min，按“2.9.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y=8.459 0X-5.573 8（r=0.991 7），在0.25～25 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.9.5 方法学考察 取0.25、12.5、25 μg／mL 葫芦素B 血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得葫芦素B 峰面积RSD（n=3）均小于10.26%，表明仪器精密度良好。取血浆样品1份，于5 d 内连续冻存和复溶，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得葫芦素B 峰面积RSD 为3.36%，表明样品在5 d 内稳定性良好。按“2.9.3”项下方法制备0.25、12.5、25 μg／mL 供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为90.62%、91.88%、93.87%，RSD 分别为5.18%、6.41%、6.02%。

2.9.6 结果分析 表5、图4显示，磷脂复合物Cmax、AUC0～16h、AUC0～∞显著高于原料药（P＜0.05），可能与其改善药物溶解性质有关，在一定程度上可促进体内透膜吸收；制成纳米结构脂质载体后，Cmax、AUC0～16h、AUC0～∞显著高于磷脂复合物（P＜0.01），tmax显著降低（P＜0.05）；与原料药、磷脂复合物比较，纳米结构脂质载体相对生物利用度分别提高到200.41%、158.22%。

表5 样品主要药动学参数（）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for samples（）

表5 样品主要药动学参数（）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for samples（）

注：与原料药比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与磷脂复合物比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

图4 样品血药浓度-时间曲线Fig.4 Plasma concentration-time curves for samples

3 讨论

金珊珊等［5］制备的葫芦素B 纳米结构脂质载体包封率仅为（78.22±3.64）%，而本实验将其制成磷脂复合物，经正交优化后包封率达到88% 左右。被包裹药物的亲脂性是影响纳米结构脂质载体包封率的重要因素之一［14］，葫芦素B 脂溶性较差，制成磷脂复合物后可大大改善［6］，并能提高该成分与液态或固态载体材料的亲和性，从而提高包封率。

体外释药行为考察结果显示，葫芦素B 磷脂复合物体外溶出非常缓慢，不利于药物快速吸收进入体循环；药动学研究结果也表明，磷脂复合物在一定程度上提高了口服吸收生物利用度，但幅度不大［9］，将其进一步制成纳米结构脂质载体后，其体外溶出速率及累积溶出度均有所提高，为顺利吸收、提高药效奠定基础［14-16］，与磷脂复合物比较，纳米结构脂质载体相对生物利用度提高至200.41%。

磷脂复合物在一般在非质子溶剂中进行制备，以水（质子溶剂）混悬液形式给药，但进入胃肠道后会导致其部分重新解离开，从而失去促吸收作用［17］。制成纳米结构脂质载体后，一方面对包裹于其中的磷脂复合物具有保护作用，另一方面可发挥纳米制剂促进药物吸收的作用，进一步提高生物利用度。

葫芦素B 磷脂复合物纳米结构脂质载体混悬液制成冻干粉是非常复杂的相变过程，加入甘露醇作为冻干保护剂后可发挥其骨架支撑作用，不但保持了纳米结构脂质载体微观结构，还可使纳米粒子之间不发生聚集粘连，这可能是由于甘露醇可通过其羟基与粒子表面基团之间形成氢键，从而在脱水过程中与水进行交换，抑制纳米粒聚集［18］。从冻干前后平均粒径、分布、Zeta 电位、体外释放行为来看，冻干粉可基本保持纳米结构脂质载体的物理性质。今后，将把研究重点放到葫芦素B 相关制剂的药效学方面，以期为其开发提供更完整的实验数据。