油炸食品中丙烯酰胺的检测方法研究

陈 煜，龚号迪，张 龑，赵贝贝，陈志成

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001； 2.南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006)

油炸是食品熟化方式的一种，油炸食品以其良好的膨松质构、独特的香味及滑爽的口感深受人们喜爱。但马铃薯、甘薯、面粉等富含淀粉的食物在油炸过程中，极易产生一种有害的化学物质——丙烯酰胺[1-3]。研究表明，天门冬酰胺参与的美拉德反应是导致丙烯酰胺产生的重要途径[4-6]。国际癌症机构将丙烯酰胺列为“人类可能的致癌物”(2A类)[7]。

丙烯酰胺的检测方法包括气相色谱、液相色谱及其联用技术，近年来新型的基于褐变的快速测定、毛细管电泳、酶联免疫、生物传感器等技术也得到了发展[8-10]，其中以液相色谱(HPLC)及其联用技术应用最为广泛[11-12]。GB/T 5009.204—2005采用液相色谱串联质谱的方法检测食品中的丙烯酰胺。阴永泼等[13]采用QuEChERS前处理淀粉类食品样品，再用高效液相色谱-质谱法检测丙烯酰胺。该方法检出限低(可低至1 μg/kg)，灵敏度高，但仪器价格昂贵，检测费用较高，不易推广。邵美丽等[14]采用固相萃取-高效液相色谱法检测油炸猪肉中丙烯酰胺，检出限6 μg/kg，加标回收率90%～92%，该法可有效检测油炸猪肉中的丙烯酰胺含量，但前处理较烦琐。

鉴于国内对于丙烯酰胺的HPLC分析仍不完善，本试验拟建立油炸食品中丙烯酰胺的提取、分离、纯化及HPLC分析方法，便于油炸食品中丙烯酰胺的快速检测，此外，对谷物科学、油脂化学等领域的进一步研究也具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

市售薯片、锅巴、麻花(河南郑州家乐福超市)。正己烷、乙酸乙酯、七水合硫酸锌、亚铁氰化钾、Carrez试剂(分析纯)，乙腈(色谱纯),丙烯酰胺标准品(天津市化学试剂研究所)，C18固相萃取小柱(安捷伦科技中国有限公司)，Milli-Q超纯水。

760 CRT型双光束紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，CLF-10C型密封性摇摆式粉碎机(浙江省温岭市创力药材器械厂)，DT5-4B型低速台式离心机(上海京工实业有限公司)，MTN-2800D型氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，MVS-1型旋涡混合器(北京金北德工贸有限公司)，KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，固相萃取装置(天津博纳艾杰尔)。

1.2 试验方法

1.2.1 丙烯酰胺标准曲线的绘制

精确称取丙烯酰胺标准品0.01 g，用超纯水配制成10 μg/mL标准溶液，过滤膜后稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，进HPLC分析，绘制质量浓度与峰面积的关系曲线。

1.2.2 样品前处理

一定量的油炸食品经100℃干燥2 h后，用粉碎机粉碎。称取5.0 g(精确至0.01 g)于100 mL烧杯中，加入40 mL去离子水，磁力搅拌30 min。转移至离心管中，3 000 r/min条件下离心30 min。取上清液，加入10 mL正己烷萃取，以除去脂溶性物质，重复萃取3次。脱脂后的样品中加入Carrez Ⅰ试剂与CarrezⅡ试剂各2 mL，净化20 min以除去样品中的蛋白质等杂质。将净化后的样品离心(10 min、4 000 r/min)，取上清液5 mL过C18固相萃取小柱，并用10 mL乙酸乙酯洗脱，将洗脱液氮吹浓缩至干，加入1 mL超纯水，旋涡混合，使丙烯酰胺充分溶解[15-16]。待HPLC检测。

1.2.3 HPLC条件

Agilent 1260高效液相色谱系统(安捷伦科技中国有限公司)，Agilent ZORBAX SB-C18高效液相色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，安捷伦科技中国有限公司)。流动相乙腈-水。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 紫外检测波长的选择

采用双光束紫外-可见分光光度计对10 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液进行全波长扫描，得到丙烯酰胺的紫外-可见分光光度计全波长扫描图如图1所示。

图1 丙烯酰胺的紫外-可见光谱图

由图1可知，丙烯酰胺的最大吸收波长在195 nm处，丙烯酰胺标准溶液在该处的吸光度为1.976，故选择195 nm为丙烯酰胺的最佳检测波长。

2.1.2 流动相的选择

丙烯酰胺是强极性化合物，流动相比例对其色谱峰形和出峰时间有较大影响。在检测波长195 nm、流速1.0 mL/min、进样量20 μL、柱温45℃的条件下，考察乙腈-水体积比分别为5∶95、10∶90、20∶80、30∶70时的色谱分离效果，结果如图2所示。

由图2可知，在乙腈与水体积比分别为10∶90、20∶80条件下，丙烯酰胺吸收峰基线分离效果较好，考虑到乙腈与水体积比在20∶80时，丙烯酰胺出峰时间较10∶90的短，故选择最佳流动相为乙腈-水(体积比20∶80)。

2.1.3 柱温的选择

在检测波长195 nm、进样量20 μL、流速1.0 mL/min、流动相乙腈-水(体积比20∶80)条件下，考察柱温分别为20、35、40、45℃时的色谱分离效果，结果如图3所示。

由图3可知，不同柱温条件下，丙烯酰胺色谱峰均能实现基线分离。柱温由20℃升至45℃，由于传质速度加快，出峰时间由1.819 min缩短至1.768 min。柱温45℃时，峰形较好，且出峰时间相对较短，因此选择丙烯酰胺色谱分离最佳柱温45℃。

2.1.4 流速的选择

在检测波长195 nm、柱温45℃、进样量20 μL、流动相为乙腈-水(体积比20∶80)条件下，考察流速分别为0.5、0.8、1.0、2.0 mL/min时的色谱分离效果，结果如图4所示。

由图4可知，随着流速的增加，丙烯酰胺吸收峰的出峰时间缩短。但流速增大至2.0 mL/min时，丙烯酰胺吸收峰未能实现基线分离。流速在1.0 mL/min时出峰时间1.770 min，且峰形较好，因此选择丙烯酰胺色谱分离最佳流速1.0 mL/min。

2.1.5 进样量的选择

在检测波长195 nm、柱温45℃、流速1.0 mL/min、流动相为乙腈-水(体积比20∶80)条件下，考察进样量分别为5、10、20、30 μL时的色谱分离效果，结果如图5所示。由图5可知，进样量为5 μL时，出峰时间1.600 min，进样量增加至30 μL时，出峰时间延长至1.824 min。但进样量5 μL时灵敏度较低，进样量10 μL时，丙烯酰胺峰与杂质峰未能实现基线分离。进样量20 μL时，丙烯酰胺峰与杂质峰完全分离，且峰形较好，故选择丙烯酰胺进样量20 μL。

2.1.6 最佳色谱条件

综合上述色谱条件的优化与选择，确定测定丙烯酰胺的色谱条件为：检测波长195 nm，流动相乙腈-水(体积比20∶80)，柱温45℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。在此条件下，丙烯酰胺可与杂质峰实现基线分离，丙烯酰胺的出峰时间为1.770 min。

2.2 丙烯酰胺标准曲线

将0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，按照上述最佳色谱条件进样。以丙烯酰胺的质量浓度(x)为横坐标，相应峰面积(y)为纵坐标建立线性回归方程。得到的线性回归方程为y=345.56x+17.371，r2=0.998 2。

2.3 检出限与精密度

在最佳色谱条件下，以信噪比S/N=3计算检出限，得到该方法的检出限为5 μg/kg。

分别配制质量浓度为1.0、10、1 000 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液和空白对照样，在最佳色谱条件下进样测定，每个质量浓度测定3次，计算标准偏差和相对标准偏差(RSD)。结果如表1所示。

表1 精密度试验结果

由表1可知，RSD在0.12%～0.46%，小于0.5%，说明该方法的精密度良好。

2.4 样品的加标回收率

准确称取已经粉碎的薯片样品4份各5.0 g，向其中3份中分别准确加入0.5 mL质量浓度为10 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，另一份作为空白对照，按1.2.2进行样品前处理操作，在最佳液相色谱条件下检测分析，计算得到样品的加标回收率分别为88.5%、90.2%、90.6%。

2.5 实际样品测定

将市售薯片、麻花、锅巴样品按照1.2.2进行前处理，并在最佳色谱条件下检测分析。得到薯片、锅巴、麻花3种油炸食品中丙烯酰胺的含量分别为731.2、592.3、441.0 μg/kg。均低于世界卫生组织规定的食品中丙烯酰胺含量不得超过1 mg/kg的规定。

3 结 论

建立了油炸食品中丙烯酰胺的提取、分离、纯化与液相色谱分析方法。油炸食品经干燥、研磨、水提后用正己烷除去油脂，用Carrez试剂除去蛋白质等杂质，再用C18固相萃取小柱纯化、洗脱后得到丙烯酰胺提取液。采用高效液相色谱法分析丙烯酰胺，研究了不同的流动相比例、柱温、流速、进样量对丙烯酰胺分离效果的影响。得到丙烯酰胺的最佳分离条件为：检测波长195 nm，流动相乙腈-水(体积比20∶80)，柱温45℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。该方法丙烯酰胺的检出限为5 μg/kg，RSD在0.5%范围内，薯片样品的加标回收率在88.5%～90.6%之间，该法能有效、快速测定油炸食品中丙烯酰胺的含量。