食用油中苯并(a)芘的快速检测研究

程 慧，黄 徽，周陶鸿，彭青枝

(湖北省食品质量安全监督检验研究院 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，武汉 430070)

食用油中苯并(a)芘(BaP)的检测方法目前主要是GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》中规定的液相色谱分析法。该方法检测粮油和肉类食品中苯并(a)芘的含量适用于非现场检测，不适用于现场的快速检测[1-2]。食品快速检验方法可以在第一时间筛出有害物质且满足市场监管的需求，其中较常用的方法有酶联免疫法、胶体金试纸法、免疫层析法[3]。这3种方法应用于食品中风险物质的定量检测难点基本上集中于抗体及人工抗原的获得，人工抗原合成的关键在于载体蛋白是否与其偶联，可通过酶联免疫试剂盒检测人工抗原的蛋白质含量，选择最佳的人工抗原及其诱导机体免疫产生的抗体组合建立免疫传感器[4-10]。免疫传感器结合比色法是一种可以应用于市场监管中食品化学性污染物检测的重要手段，其成功解决了如何将免疫识别转化为快速且裸眼可见的难题，在食品中重金属及农药残留等化学污染物残留的快速检测领域具有仪器价格低廉、检测速度较快等优点。

传统的免疫比色反应一般是基于酶标记物催化底物实现显色反应，单纯的酶标记抗体信号放大作用比较局限。一般的信号放大措施仅实施在标记抗体表面，而本试验通过磁珠标记识别抗原磁珠标记的抗原与苯并(a)芘标准溶液竞争抗体后，再与酶标记抗体结合后进行显色反应，苯并(a)芘标准溶液质量浓度越低，磁珠标记抗原结合的酶标记物显色越深，最后加入终止液洗脱后检测体系的吸光度可以间接反映苯并(a)芘标准溶液质量浓度。免疫磁珠的制备过程及其免疫分析原理见图1。

图1 免疫磁珠的制备过程及其免疫分析原理示意图

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用小鼠由武汉华美生物工程有限公司提供，食用油样品均为市场抽检样品。苯并(a)芘、苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲标准品，北京中科质检生物技术有限公司；苯并(a)芘单克隆抗体、苯并(a)芘羊抗鼠二抗、苯并(a)芘包被抗原，武汉华美生物工程有限公司；羧基化磁珠(MB，粒径1.0～2.0 μm，10 mg/mL)，购自美国Charm生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、4-吗啡啉乙磺酸(MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、脲酶(Canavalia ensiformis，Type III)，购自美国Sigma-Aldrich公司；正己烷、二甲基亚砜、氢氧化钠，购自国药集团有限公司。

JN100-4恒温混匀仪，UV-1901紫外-可见分光光度计，Waters e2695Alliance高效液相色谱仪，AB SCIEX 4500液相串联质谱。

1.2 试验方法

1.2.1 苯并(a)芘人工抗原及抗体的制备及筛选

根据文献[3]提供的方法合成苯并(a)芘的人工抗原及单克隆抗体，将合成的H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3种免疫原免疫小鼠，免疫5次后选取效价及抑制率较高的试验小鼠进行剂量加大的免疫试验，提取小鼠的抗血清，纯化后获得相应单克隆抗体，利用间接竞争酶联免疫法筛选出有效包被抗原和抗体的组合，通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对已经筛选出的抗体进行性能测试。同时，选取与苯并(a)芘分子结构类似的苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲同样进行间接竞争酶联免疫法，进一步测试该单克隆抗体的交叉反应率。

1.2.2 快速检测苯并(a)芘显色反应的构建

取4 μL(25 mg/mL)MB依照文献[10-12]方法在其表面共价结合苯并(a)芘包被抗原(4 μg)及抗体(4 μg)，并将其重新分散在400 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲溶液中，4℃保存待用。将40 μL已处理的免疫磁珠分散液与100 μL不同质量浓度的苯并(a)芘标准溶液或样品提取液在离心管中混合均匀，加入70 μL 50 mmol/L苯并(a)芘单克隆抗体，37℃涡旋混匀反应30 min，再加入酶标苯并(a)芘二抗[10]100 μL，37℃涡旋混匀反应30 min，所得混合液经磁分离后，采用100 μL pH 7.0 50 mmol/L PBST(吐温体积分数为0.2%)和100 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl交替洗3次。最后向其中依次滴加100 μL 0.1 mol/L HCl和100 μL 50 mmol/L四甲基联苯。充分混匀，静置2 min后，将上清液于550 nm测定吸光度。

1.2.3 食用油样品前处理

称取10 g油样于离心管中，加入5 mL 正己烷和15 mL二甲基亚砜并混合均匀。旋涡振荡2 min，然后4 000 r/min离心2 min。弃去上层正己烷层。加入5 mL 正己烷，旋涡振荡30 s，然后4 000 r/min离心30 s。弃去上层正己烷层。加入10 mL 氢氧化钠溶液(2 mol/L)和15 mL正己烷，旋涡振荡30 s，然后4 000 r/min离心30 s。吸取上层正己烷层于15 mL离心管，4 000 r/min离心2 min。取正己烷层于氮吹管中，50℃氮吹或空气吹10 min，然后加入200 μL二甲基亚砜复溶，混合均匀，备用。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的设计及分析

苯并(a)芘的分子结构中不含氨基、羧基、羟基等可与载体蛋白直接偶联的基团，通过有机反应引入与载体蛋白结合的基团是目前合成人工抗原常用的方法，所得产物需核磁共振图谱验证，过程烦琐。因为人工抗原的目的是刺激宿主产生相应抗体，其结合蛋白质的含量可间接验证活泼基团的引入，由于在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+，而二喹啉甲酸试剂可特异地与蛋白质分子结合，形成有颜色的复合物，该复合物在562 nm处有高吸光度，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸光度计算蛋白质的含量[7-8]。图2为1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原和10 μg/L苯并(a)芘的紫外吸收光谱图。

图2 1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原(a)和10 μg/L苯并(a)芘(b)的紫外吸收光谱图

由图2可以看出，苯并(a)芘人工抗原相较于苯并(a)芘在550 nm处有明显的特征吸收峰，表明苯并(a)芘人工抗原成功合成。

2.2 单克隆抗体的特异性

将H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3种人工抗原分别对小鼠进行免疫试验，2个月后提取小鼠血清，利用间接酶联免疫法测定抗血清的效价，结果见表1。

表1 人工抗原和抗体的间接酶联免疫检测结果

由表1可知，小鼠对3种人工抗原均产生了免疫反应，测得的血清效价符合常规要求，其中血清效价及抑制率最高的是H-BaP-OVA，故选择该人工抗原作为试验抗原及抗体的制备来源。

以H-BaP-OVA为包被抗原，采用该人工抗原刺激小鼠产生的抗体建立酶联免疫检测标准曲线，如图3所示。

由图3可以看出，当苯并(a)芘的质量浓度为0.05～10.00 mg/L时，抑制率与苯并(a)芘质量浓度的对数成良好的线性关系，R2=0.995 6。

通过间接竞争酶联免疫对抗体的灵敏度及特异性进行测定，结果见表2。

由表2可知，H-BaP-OVA作为人工抗原筛选出的抗体可灵敏识别苯并(a)芘，其灵敏度为5.37 μg/L，抗体对苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲的交叉反应率很低，证明该抗体特异性较好。

图3 苯并芘的酶联免疫法检测曲线

化合物半数抑制质量浓度/(μg/L)交叉反应率/%苯并(a)芘>5.37>100苯并蒽>1.23>1.19苯并荧蒽>1 000<0.01苯并苝>1 000<0.01菲>1 000<0.01

2.3 条件优化

为了确保基于免疫磁珠的反应有最佳的酶催化信号转导，在其他试验条件一致的情况下(1.2.2试验方法)，分别考察了抗体和辣根过氧化酶的用量，结果如图4、图5所示。

图4 抗体用量对吸光度的影响

图5 辣根过氧化酶用量对吸光度的影响

从图4可以看出，在抗体用量低于4 μg时，100 ng/mL苯并(a)芘的信号响应随着抗体用量的增加而不断增大，直到抗体用量达到4 μg开始平缓。这说明抗体用量低于4 μg时，不能足够识别抗原及酶标二抗，但是过多的抗体也会影响信号转导。

从图5可以看出，在高盐溶液中100 μg辣根过氧化酶使纳米探针的分散性更好，且产生较强的信号响应。因此，选择4 μg苯并(a)芘抗体和100 μg辣根过氧化酶作为合成纳米探针的最佳条件。

温育时间是影响免疫分析性能的另一个重要因素。试验研究了不同温育时间下100 ng/mL BaP在免疫磁珠上的信号响应情况，结果见图6。

图6 温育时间对吸光度的影响

从图6可以看出，随着免疫反应温育时间的延长，响应信号不断增大，直到温育时间达到60 min后响应达到一个平台。这说明该免疫磁珠温育60 min时免疫反应可以达到饱和状态，因此选择60 min作为免疫反应分析的最佳温育时间。

2.4 方法的线性回归方程和检测限

在最优试验条件下，配制0.5 pg/mL～500 ng/mL 的苯并(a)芘标准溶液，采用1.2.2方法测定吸光度。结果表明，吸光度与苯并(a)芘质量浓度的对数呈较好的线性关系，线性回归方程为：A=1.819 3-0.432 3lgC，相关系数为0.992，检测限为0.12 ng/mL，定量限为0.5 μg/kg，比文献[1,9,13]低得多。

2.5 方法的特异性

分别考察了2、5、10 ng/mL的苯并(a)芘、苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲标准品在该免疫磁珠上的信号响应，用免疫磁珠检测，每个样品重复3次，判断免疫磁珠的特异性。结果见表3。

表3 苯并(a)芘、苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲标准品分别在免疫磁珠上的响应情况

从表3可以看出，与苯并(a)芘在该免疫磁珠上的灵敏信号响应相比，苯并蒽、苯并荧蒽、苯并苝、菲在该免疫磁珠上没有引起明显的信号响应，说明非特异性多环芳烃在该免疫磁珠上引起的交叉反应较小。

2.6 方法的稳定性

在最优试验条件下，用同批次和不同批次的免疫磁珠分别检测1、10、100 ng/mL苯并(a)芘标准品，每个样品重复测定5次，结果如表4所示。

表4 方法的稳定性试验结果

由表4可知，该免疫磁珠具有较好的重复性和稳定性，RSD为3.4%～5.3%。

2.7 方法的加标回收率

在食用油样品中添加一定量的苯并(a)芘标准品，使苯并(a)芘质量浓度为0.5、2、5、10 μg/kg，样品经1.2.3、1.2.2方法处理。所选食用油样品经液相色谱法确定为未检出苯并(a)芘。经提取回收，将液相色谱、液质联用、电化学传感器法所得分析结果与免疫磁珠分析结果相比较(液相色谱条件为C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、流动相为乙腈-水(88∶12)、流速1.0 mL/min、荧光检测器激发波长384 nm、发射波长406 nm、柱温35℃、进样量20 μL)。液质联用条件参考文献[13]。电化学传感器法参考文献[14])。结果见表5。

表5 不同方法的加标回收试验结果

由表5可知，本方法平均加标回收率为89.3%～100.1%，本方法的测定结果与其他3种方法测定结果相近，表明本方法用于实际样品分析苯并(a)芘含量具有良好的可靠性和准确度。

3 结 论

本研究应用间接免疫法结合显色反应快速检测食用油中苯并(a)芘。通过在磁珠结合苯并(a)芘抗原，进一步连接抗体及酶标二抗，因辣根过氧化酶与四甲基联苯发生的经典显色反应，从而间接检测苯并(a)芘含量。此方法的检出限为0.12 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg，加标回收率为89.3%～100.1%，方法具有良好的特异性和稳定性，可实现食用油中苯并(a)芘的快速检测。