SGK1在日光性角化病、基底细胞癌及鳞状细胞癌中的表达

孟琴琴 郭美亮 范 晴 袁定芬 邓 辉

日光性角化病(actinic keratosis，AK)、基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)及鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是与紫外线和化学因素等有关的皮肤肿瘤。三者均多见于中老年皮肤白皙者。AK的发病在基因水平上可能与P53基因的表达下调导致细胞更少的增值抑制与凋亡有关。研究发现，AK与SCC中凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)明显降低，其中AK作为癌前期皮肤病是鳞癌的诱发因素之一[1,2]。血清和糖皮质激素蛋白激酶(serum and glucocorticoid-regulated protein kinases，SGKs)在多种肿瘤中作为判断预后的标志并作为治疗的靶点。SGK1亚基的磷酸化不仅调控细胞的增殖和分化，而且促进细胞的存活和凋亡抑制。SGK1在许多恶性肿瘤中高表达，例如非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌等[3-6]。同时，SGK1对黑素瘤细胞的肺转移也具有促进作用[7]。在高渗盐氯化钠存在的条件下，SGK1对特应性皮炎的发展具有促进作用[8]。但是目前SGK1在非黑素瘤皮肤癌(non-melanoma skin carcinoma，NMSC)中的研究尚未有发现。本研究旨在通过检测正常皮肤组织(normal skin，NS)、AK、BCC及SCC中SGK1水平，初步探讨其在AK、BCC和SCC发生发展过程中的作用及意义，为临床早期诊断和治疗提供理论基础。

1 材料及方法

1.1 组织标本 AK标本25例，BCC标本28例，SCC标本28例及正常标本25例均来自本院。临床和人口资料取自患者档案，病理资料来自本院病理科医师。石蜡包埋的组织经常规HE染色分别确诊为AK，BCC，SCC及正常标本NS。正常组织取自良性肿块周围的正常皮肤。各组年龄及性别均无统计学差异(表1)。

表1 标本的年龄及性别分布

1.2 试剂 SGK1抗体购自美国Abcam公司(ab32374)，稀释浓度为1∶200，免疫组化试剂盒(SA1022)购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 免疫组化 将石蜡包埋组织块切成4 μm厚的组织切片，贴于免疫组化专用载玻片上。采用SABC法进行免疫组化染色。步骤如下：石蜡切片62℃烘箱烘烤1 h，三份二甲苯中分别浸泡15 min脱蜡，梯度酒精水化后将组织切片置于PH=9.0的EDTA修复液中用水浴锅加热法抗原修复20 min。0.5%的Triton-100对细胞膜进行破膜处理，3%的过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶10 min。5%的牛血清白蛋白封闭非特异性结合60 min。组织切片上加SGK1抗体4℃过夜孵育。生物素标记的山羊抗兔免疫球蛋白作为二抗室温孵育30 min，SABC复合物37℃孵育30 min。DAB作为显色剂，苏木精作为复染剂，依次加入。依照试剂说明，上述步骤每一步操作后用PBS清洗玻片。除了特殊说明外，所有孵育均在常温下进行。

1.4 结果判定 SGK1染色后，每个标本随机选择三个高倍视野(HPFs，200)，利用Image Pro Plus软件进行阳性细胞率分析，计算出三个视野中的平均阳性细胞率。采用半定量评估方法将染色分为四个等级：阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)以及强阳性(+++)(表2)。

表2 半定量评估方法

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析结果。计数资料采用卡方检验，多组之间阳性细胞率的比较使用方差分析，其中两两比较采用方差分析LSD法。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化照片

2.2 SGK1在正常皮肤的表达 在正常皮肤标本中，SGK1弱阳性表达，阳性着色主要定位于表皮基底层的细胞质(图1)。

2.3 SGK1在AK中的表达 在25例AK中，3例(12%)强阳性表达(表3)；大部分AK标本中，SGK1弱阳性或阳性表达，主要表达于增厚的表皮基底层的细胞质(图2)；AK中SGK1阳性细胞率与正常标本相比无统计学差异(表5)。

表3 SGK1的表达

表4 AK，BCC，SCC与正常组织中SGK1强阳性率的比较

2.4 SGK1在BCC中的表达 在28例BCC中，16例(57.14%)强阳性表达(表3)，表达于癌细胞的胞质和胞核(图3)。BCC组织中SGK1阳性细胞率明显高于正常标本和AK标本，差异具有统计学意义(表3，5)。

2.5 SGK1在SCC中的表达 在28例SCC中，14例(50%)强阳性表达(表3)，在癌细胞的胞质和胞核中均强阳性表达(图4)。 57.14%的BCC和50%的SCC出现强阳性表达，明显高于正常皮肤组织中的强阳性率，差异具有统计学意义(表3，4)。SCC标本中SGK1阳性细胞率明显高于AK与正常组织，差异具有统计学意义(表3，5)。

表5 SGK1阳性细胞率的两两比较

2.6 统计分析结果 BCC和SCC中SGK1强阳性率明显高于正常标本，差异具有统计学意义；AK强阳性率与正常标本相比差异不具有统计学意义(表3，4)。BCC和SCC中SGK1阳性细胞率明显高于NS和AK组织，且差异具有统计学意义；BCC和SCC阳性细胞率比较不具有统计学差异，AK和NS阳性细胞率比较也不具有统计学差异(表3，5)。

图1 1a、1b、1c:SGK1在正常皮肤组织中表达(免疫组化，×40，×200，×400)图2 2a、2b、2c:SGK1在AK组织中表达(免疫组化，×40，×200，×400)图3 3a、3b、3c:SGK1在BCC组织中表达(免疫组化，×40，×200，×400)图4 4a、4b、4c:SGK1在SCC组织中表达(免疫组化，×40，×200，×400)

3 讨论

SGK1属于丝氨酸/苏氨酸激酶的亚家族，其受到多种刺激的急性转录调控，包括血清和糖皮质激素。SGK1被证明影响许多生理功能，如细胞增殖，分化和凋亡[9,10]，且与细胞迁移有关。一方面，细胞的迁移主要依赖于Ca2+信号传导[11]，在细胞内质网Ca2+储存耗尽后， SGK1上调膜上钙离子释放激活钙离子通道蛋白(Calcium-release- activated-calcium，Orai1)的数量进而促进Ca2+依赖性肿瘤细胞的迁移[12]。 另一方面，在慢性心理压力下， SGK1的表达升高导致P53(肿瘤抑制蛋白)的功能减弱或丧失，促进了肿瘤的发生[13]。最后，Wnt信号通路的激活诱导SGK1的表达导致叉头框蛋白O家族(forkhead box protein O，FoxOs)的核外移，最终抑制FoxOs介导的细胞凋亡[14]，促进肿瘤的发展。基于这些机制，SGK1在多种肿瘤中被研究，与SGK1在皮肤鳞状细胞癌中的表达模式相比，在肺非小细胞肺癌和原发性转移性前列腺癌中，SGK1呈不均匀着色，在癌细胞团周边的癌细胞中，SGK1强阳性着色，在其内部的细胞则为灶性着色[15,16]。除了自身代谢对肿瘤发展的影响，作为新型免疫调节抑制剂，SGK1对免疫促炎细胞因子如白介素1(Interleukin1，IL-1)表达的抑制导致肿瘤的免疫逃避，促进肿瘤的发生[17]。

细胞内外多种刺激均可引起SGK1表达的升高。真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E)在BCC中表达升高[18]，eIF4E能够上调AKT蛋白的表达[19]，考虑到AKT蛋白与SGK1蛋白在基因序列上具有一致性，我们推测在BCC中eIF4E可能通过上调SGK1的表达参与了BCC的发展过程。紫外线(ultraviolet，UV)的曝晒导致AK和SCC中基因的表达较未受紫外线照射的皮肤明显上调[20]。AK到SCC的发展是一个连续的过程，这一过程受紫外线曝晒的影响，而SGK1在皮肤鳞状细胞癌中高表达[3,5,15]，这进一步证实了 SGK1在皮肤鳞状细胞癌中的高表达与紫外线曝晒密切相关，进而说明SGK1在皮肤鳞状细胞癌发生发展中的作用。

本实验中，BCC和SCC的SGK1阳性细胞率均明显高于正常和AK标本，这可能是SGK1的高表达导致其相关蛋白转录调节的紊乱，进而导致BCC和SCC的发病。总之，我们证实了SGK1在非黑素瘤皮肤癌(non-melanoma skin carcinoma，NMSC)中可能的致癌作用。受UV曝晒及其他多种因素的影响，皮肤组织中SGK1的表达升高，其高表达导致细胞代谢和功能的紊乱，进而导致BCC和SCC的发病，并影响BCC和SCC的预后。